Rutina de Inmunohematologa

Resolviendo Problemas

clauperon@hotmail.com

Pruebas Imunohematolgicas

Fenotipificacin ABO
Fenotipificacin RhD Test de Antiglobulina Directo (Coombs Directo) Test de Antiglobulina Indireto (Coombs Indirecto)

Principio de los Test Inmunohematolgicos

Los mtodos se basan en el principio de la hemaglutinacin
Que debe Indicar si hubo o no unin del Anticuerpo con el antgeno

Gel Test

Prueba en Tubo

Microplaca

Principio de los Test Inmunohematolgicos

Reacin de Aglutinacin

La reaccin de aglutinacin es um fenomemo complejo que involucra muchas varibles.

Aglutinacin especfica y inespecfica.

En ImH usamos la reaccin de aglutinacin como una herramienta que nos indica se hube o no la union Ag-AC. (Agl especfica).

Ac conocidos Ag conocidos

Ag Ac

Aglutinacin

La aglutinacin ocurri

cuando la fuerza de repulsin entre los hemates es superado.

Esto ocurre por alteracin de la membrana de los hematies, o del medio en lo cual ellos estn en suspensin.

Cuidado ! Ni siempre la presencia de aglutinacin significa presencia de la reaccin Ag-Ac Ni siempre, la ausencia de aglutinacin garantiza que no hubo la reaccin Ag-Ac 6

Fenotipificacin ABO
La fenotipificacin ABO corresponde a la pesquisa de los antgenos A/B en los hemates y de los anticuerpos naturales antiA, Anti-B del plasma.

Prueba Directa: se utilizan reactivos Anti-A y Anti-B comerciales para la pesquisa de los antgenos
Prueba Inversa: se utilizan hemates A1 y B para la pesquisa de los anticuerpos naturales ABO (isoaglutininas)
Prova direta Prueba inversa Prueba directa Prueba inversa

Tab A
Prova reversa

Discrepancias en la Fenotipificacin ABO

Que es discrepancia ABO???
La discrepancia ocurre cuando el resultado de la Prueba Directa no concuerdacon el resultado de la Prueba inversa

Resultados discrepantes deben ser investigados para la liberacin de un resultado correcto

Discrepancia em la Fenotipificacin ABO

Qu hacer???
Identificar el problema:

En la mayora de los casos, la discrepancia est relacionada a problemas tcnicos u otros: errores digitacin
problemas con Reactivos o Equipamientos errores durante el procedimiento

En otros casos, existe una discrepancia verdadera, relacionada con la muestra (hemates o plasma/suero)

Discrepancias Errores Tcnicos

Errores Clericais:
tubos mal/no identificados
muestra identificada incorrectamente (cambio de muestra) error de transcripcin de resultado error de digitacin

Problemas con Reactivos o Equipamientos: reactivos vencidos

reactivos contaminados equipamiento descalibrados

Errores de Procedimiento: reactivos no adicionados

no observar las orientaciones do fabricante suspensin de hemates en concentracin inadecuada lectura de los resultados (resuspensin inadecuada)

Discrepancias ABO - Verdaderas

Problemas em la Prueba Directa (Hemates):

antgenos ABO con reatividad dbil o ausente

reatividad extra

Problemas em la Prueba inversa (Plasma):

anticuerpos ABO con reatividad dbil o ausente

reatividad extra

Discrepancias ABO
Prueba Direta - reatividad dbil o ausente
Anti-A 0 (2+) Subgrupos ABO:
presentan menos sitios antignicos por hemate reatividad ms dbil o ausencia de reatividad con los reactivos Anti-A/-B.
~ 80% de los indivduos A/AB son A1; 19% A2, 1% otros subgrupos (A3, Ax, Am ,Aint, Ael Ay,etc.)

Anti-B 0

Hemate A1 0

Hemate B 4+

Patologas (ex: leucemia)

RN (antgenos inmaduros) Otros (reacin con doble-poblacin):
Transfusiones recientes (doble poblacin)
Transplantes (quimeras)

Discrepancias ABO
Prueba Directa - reactividad dbil o ausente Cmo Resolver???
Subgrupos ABO:
aumentar tiempo de incubacin y disminuir temperatura de

incubacin utilizar Anti-A1, Anti-H tcnicas de fijacin/elucin

Verificar datos clnicos (RN, patologa) - RN (repetir pruebas posteriormente)

Discrepancias ABO
Ejemplo: Prueba Directa - reactividad dbil o ausente
Histrico de tipificacin Grupo O. Paciente saludable, sin histrico clnico.

Directa: O

Inversa: A

SOLUCIN??? Fijacin/ Elucin: eluado reactivo con hemate A Ex: A dbil (probable subgrupo Ael)

Discrepancias ABO
Prueba Directa - recatividad extra
Anti-A 4+ Anti-B 1+ Hemate A1 0 Hemate B 4+

Reactivos/muestras (contaminacin)
Rouleaux (test en tubo) Muestra de cordn (gelatina de wharton)

Presencia de auto-anticuerpos fros e IgG alto ttulo

Poliaglutinacin (ex: antgeno T) Fenmeno B adquirido

Discrepancias ABO
Prueba Directa - reactividad extra Cmo Resolver???
Realizar TAD (auto-anticuerpos fros/calientes)
lavar hemates con solucin salina calentada 37C/ID-Diluent 2 utilizar tcnicas de disociacin de auto-anticuerpos

Hemates de cordn (lavar hemates) Fenmeno B Adquirido y Poliaglutinacin (Ex: antgeno T) utilizar reactivos monoclonales (menos proteico, no reacciona con antgeno
T, no reacciona con B adquirido)

Discrepancias ABO
Exemplo: Prueba Directa - reactividad extra

Conducta inicial: lavar hemates con ID-Diluent 2 calentado o salina calentada y repetir fenotipificacin

Ex: presencia de auto-anticuerpos fros fijados a los hemates

Discrepancias ABO
Prueba Inversa - reatividad dbil o ausente
Anti-A 4+ Anti-B 0 Hemate A1 0 Hemate B 0

Bajo ttulo de anticuerpos (nios e ancianos) Ausencia de anticuerpos (hipo o agamaglobulinemia, medicamentos)

Cmo resolver ???

Verificar datos clnicos (RN/ nios, ancianos, patologa, medicamentos)

Aumentar tiempo de incubacin y disminuir temperatura de incubacin

Discrepancias ABO
Ejemplo: Prueba Inversa - reactividad dbil o ausente

Directa: A

Inversa: O

4 oC

Ex: anticuerpos anti-B en bajo ttulo

Discrepancias ABO
Prueba Inversa - reatividad extra
Anti-A 4+ Anti-B 0 Hemate A1 1+ Hemate B 4+

Auto-anticuerpos fros libres en el plasma

Aloanticuerpos (reactivos a TA: anti-M,-N,-Le,-P1) Patologas (uso de expansores plasmticos, fibringeno elevado, hipergamaglobulinemia)

Cmo resolver???
Autocontrol positivo: repetir PI a 37C (auto-anticuerpos fros)
Autocontrol negativo: realizar la pesquisa e identificacin de anticuerpos irregulares (repetir PI a 37C) investigar subgrupos (presencia de anti-A1 natural )

Discrepancias ABO
Exemplo: Prueba Inversa - reactividad extra

Ex:auto-anticuerpos fros
Repetir PI a 37oC Repetir PI con suero auto-adsorvido

Fenotipificacin RhD
El antgeno D es el ms importante antgeno de grupo sanguneo despus de los antgenos A y B. El antgeno RhD pertenece al sistema Rh:
sistema complejo que posee 49 antgenos principales antgenos: D; C/c; E/e

El antgeno RhD posee alta inmunogenicidad y est envuelto en la EHRN y RHT.

La fenotipificacin RhD corresponde a pesquisa del antgeno RhD en los hemates

Fenotipaificacin RhD
RhD negativo RhD positivo:

RhD normal - 10.000 a 25.000 sitios/hemates (resultados positivos fuerte) RhD dbil - 66 a 5.000 sitios/hemcia (en Tubo: detectado a travs del test de AGH. En Gel: detectado directamente, reacciones < 3+) RhD parcial - 500 a 25.000 sitios/hemates (puede presentar resultado positivo fuerte o positivo dbil).

RhD Normal

RhD dbil

RhD parcial

RhD parcial

Discrepancias RhD
Causas de Discrepancias RhD:
Polimorfismo del antgeno (D dbil/D parcial) Disponibilidad de diferentes reactivos para fenotipificacin (diferentes clones) Presencia de auto-anticuerpos fijados in vivo (alo/EHRN) - TAD positivo Poliaglutinacin (contaminacin gelatina de wharton, exposicin de criptoantgenos) Patologas Contaminacin de reactivos/muestras Errores Tcnicos : clerical/procedimientos

Discrepancias RhD
Cmo resolver???
Verificar: procedimientos/ reactivos
repetir pruebas verificar resultado del ctl de D

Realizar TAD (presencia auto-anticuerpos/ aloanticuerpos fijados in vivo) ctl positivo: lavar hemates
repetir test con reactivos monoclonales utilizar tcnicas de disociacin de anticuerpos

Reacciones en GEL para RhD

Discrepancias RhD
Cmo resolver???
Pesquisa de D dbil/parcial
utilizar otros reactivos
tipificacin D parcial

estudios moleculares
Tipificacin D parcial

Discrepancias RhD
Ej: paciente con histrico de resultado RhD negativo y RhD positivo (Ddbil)

RhD dbil

RhD neg

RhD parcial categoria VI

Test de Antiglobulina Directo (TAD) o Coombs Directo

Prueba simple y eficiente, utilizado para demostrar la presencia de inmunoglobulinas y/o fracciones de complemento fijados a los hemates. Utilizado para:

Investigacin de AHAI Investigacin de la hemlisis inducida por drogas

Investigacin da Enfermedad Hemoltica Peri-Natal (EHRN)

Investigacin de Reacin Hemoltica Transfusional

Test de Antiglobulina Directo

TAD Poliespecfico TAD Monoespecfico

IgG Subclase

IgG Dilucin

Test de Antiglobulina Directo (TAD)

Causas de resultados falso positivos:

Suspensin de hemates en concentracin inadecuada (superior a lo indicado) Centrifugacin por tiempo y velocidad sobre lo indicado (tubo) Poliaglutinacin (rouleaux, gelatina de Wharton) Contaminacin de reactivos/muestras Muestra de sangre inapropiada

Test de Antiglobulina Directo (TAD)

Causas de resultados falso negativos:
Suspensin de hemates inadecuada (inferior a lo indicado) Centrifugacin por tempo y velocidad inferiores a lo indicado (tubo) Lectura inadecuada de la reaccin aglutinacin (tubo) Lavado inadecuada de los hemates antes del test (tubo) Reactivos inadecuados/contaminacin (cambio de cuenta-gotas y neutralizacin de la AGH) (tubo) Importante: realizar control de Coombs: hemates sensibilizados por IgG (tubo)

Test de Antiglobulina Indirecto o Coombs Indirecto

Test realizado para verificar la presencia de anticuerpos antieritrocitarios en el suero/plasma.
Utiliza el suero de Coombs o suero antiglobulina humana (AGH)

Anticuerpos anti-eritrocitarios estn implicados: Enfermedad Hemoltica Peri-Natal* (EHRN) Reacciones Transfusionales Hemolticas

Test de Antiglobulina Indirecto

Consideraciones Importantes: El Test de Antiglobulina Indirecto debe ser realizado utilizando hemates de fenotipo conocido que presentan los principales antgenos de importancia clnica (Tabla 1) Resultados negativos deben ser confirmados con hemates control de Coombs (tubo) Resultados positivos: realizar autocontrol
realizar identificacin de anticuerpos irregulares (Tabla 2)

Anticuerpos no implicados en EHRN: clase IgM

anticuerpos direccionados a antgenos inmaduros o ausentes en los hemates fetales/RN

Referencias Bibliogrficas

DANIEL, G. & BROMILOW, I. Essential Guide to Blood Groups. Oxford: Blackwell Publishin, 2007. 99p RUDMANN, S. V. Serologic Problem-Solving. Bethesda: AABB Press, 2005. 193p

Hemates para Pesquisa de Anticuerpos Irregulares

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Hemates para Identificacin Anticuerpos Irregulares

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Antgenos Grupo en los ABO hemates

Anticuerpos naturales en el plasma

A B

ANTI-B

ANTI-A

AB
O

ANTI-A + ANTI-B

Fenmeno B Adquirido
Individuo Grupo A B Adquirido

N-acetil galactosamina

Galactosamina se asemeja a D-galactosa (antgeno B)

Accin de enzima bacteriana remueve el grupo acetil

Gracias!

clauperon@hotmail.com