OBJETIVOS

Observar a atividade da enzima urase e a ao dos agentes desnaturantes sobre a enzima.

INTRODUO
A urease catalisa a hidrlise de ureia em dixido de carbono e amnia. Em 1926 James Summer mostrou que a urease era uma protena e tem como objetivo identificar o carbonato de amnio atravs do vermelho de fenol, (que em meio alcalino cora-se em rosa e em meio cido ou neutro, cora-se em amarelo). Encontra-se principalmente em sementes, microrganismos e invertebrados. Nas plantas, a urease um hexmero consiste em seis cadeias idnticas e localiza-se no citoplasma. Em bactrias, constituda por duas ou trs subunidades diferentes. Algumas enzimas requerem um componente no proteico para sua atividade denominado cofator. O cofator enzimtico da urease o on metlico Ni 2+ portanto, a presena de ons de nquel ativa o stio da urease e essencial tanto para a atividade funcional como para a integridade estrutural dessa enzima. Alm de ter sido a primeira enzima isolada na forma cristalina. Atualmente a urease utilizada em procedimentos de diagnsticos clnicos, na determinao de ureia em fludos biolgicos como urina e sangue.

MATERIAIS E MTODOS

Os materiais usados foram: Soluo de urase; reativo de Biureto; soluo de ureia 1% em tampo fosfato 0,01 M; soluo de tioureia em soluo fosfato 0,01 M; soluo vermelho de fenol; soluo de cloreto de mercrio 5%; cido ntrico concentrada; Tubos de ensaio; Estante para tubos de ensaio; Banho-maria; Pipeta pasteur; gua destilada;

O primeiro procedimento foi a reao de Biureto, que consiste em o on cplico fornecido pela soluo de sulfato de cobre em se complexar com os grupos amino das ligaes peptdicas. Dois tubos foram separados. No tubo 1 foi adicionado 2 mL de gua destilada, 10 gotas de soluo de urase + 2 mL de reativo de Biureto. No tubo 2 foi adicionado 2 mL de gua destilada e 2 mL do reativo de Biureto e observado o resultado.

O segundo procedimento foi a reao de Heller, que fundamenta-se na precipitao de protenas pela ao de cidos fortes. Foi separado um tubo, chamado de tubo 3: Adicionamos 5 gotas da soluo de urase e 2 mL de gua destilada, agitando em seguida. Adicionamos inclinado e cuidadosamente no tubo de ensaio 1 mL de cido ntrico concentrado, ento observamos o resultado. O terceiro procedimento foi o teste de atividade da enzima e utilizamos o vermelho de fenol para observar se houve ou no reao. Separamos 2 tubos de ensaio: No tubo 4 foi adicionado 3 mL de soluo de ureia e 5 gotas de soluo de urease. No tubo 5 adicionamos 3 mL de gua destilada e 5 gotas de soluo de urease. Em ambos adicionamos 1 gota de vermelho de fenol e aquecemos por 5 minutos em banho maria a 37C e observamos o resultado. O quarto procedimento foi a desnaturaa da enzima pelo calor. Separamos um tubo de ensaio: Tubo 6. Colocamos 2 mL de gua destilada e cinco gotas de soluo de urease, agitamos e colocamos em banho maria a 100 C por 2 minutos. Ento adicionamos 3 mL de soluo de ureia e 1 gota de vermelho de fenol, adicionando logo em seguida ao banho maria 37 C por 5 minutos e observamos. O quinto procedimento foi a inibio da enzima por meio de mercrio, separamos novamente 1 tubo de ensaio: Tubo 7, adicionamos 2 mL de gua destilada, cinco gotas de urease e 5 gotas de cloreto de mercrio 5%. Agitamos e adicionamos 3 mL de esoluo de ureia, mais 2 gotas de vermelho de fenol, misturando logo aps e colocando em banho-maria 37 por cinco minutos. O sexto procedimento foi quanto a especificidade da enzima. Separamos dois tubos de ensaio: Tubo 8 foi adicionado 3 mL de soluo de ureia e 5 gotas de soluo de urease. No tubo 9 colocamos 3 mL de

tioureia e 5 gotas de soluo de urease. Em ambos foi adicionado 1 gota de vermelho de fenol e mantido em banho maria a 37 C por 5 minutos para observarmos o resultado.

RESULTADOS E DISCUSSO

Tubo 1: Houve reao; Tubo 2: No houve reao;

Tubo 3: Houve formao do anel, portanto a protena precipitou; Tubo 4: Houve reao, a soluo ficou corada de rosa; Tubo 5: No houve reao, a soluo corou-se de amarelo; Tubo 6: No reagiu, pois a temperatura alta desnaturou a enzima; Tubo 7: No houve reao, pois o mercrio impediu a atividade enzimtica. Tubo 8: Houve reao; Tubo 9: No houve reao, pois a enzima urease no reage com tioureia.

QUESTES

1) Qual a reao catalisada pela urease? a reao da soluo de uria com a enzima urease.

2) Qual a fonte de urease utilizada nos experimentos? a farinha de soja.

3) Como pode ser evidenciada a natureza proteica da enzima? Pela reao de Biureto, pois este reativo age somente sobre as ligaes peptdicas da urease, comprovando sua natureza proteica.

4) Explique o uso do indicador cido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima. Quando a urease reage com a uria, ela deixa a soluo alcalina, ento o vermelho de fenol adicionado para indicar se o meio est cido ou bsico, se a soluo ficar rosa, comprova que houve reao (atividade enzimtica).

5)Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida. No houve reao, pois o calor (por ser um agente desnaturante), desnaturou a enzima urease, impossibilitando sua atividade.

6)Explique os resultados obtidos no teste de sais de mercrio com especificidade da enzima.

Com relao ao mercrio, este um metal pesado e por isso um agente desnaturante, que impediu a atividade da enzima urease (resultado). Com relao s relao s reaes de ureia e tioureia, as enzimas so extremamente especficas quando ao seu substrato, portanto s ocorreu a reao da urease com a uria, j na reao com a tioureia, no houve atividade enzimtica.

CONCLUSO

Conclumos que atravs dos experimentos realizados pudemos conhecer no s sobre enzimas e seus substratos, mas tambm sobre seus agentes desnaturantes, que so comuns aos das protenas, visto que muitas enzimas tambm possuem estruturas de aminocidos e ligaes peptdicas. Esse conhecimento mais facilmente adquirido na prtica, onde podemos ver com facilidade a finalidade dos diversos assuntos englobados pela Bioqumica.

BIBLIOGRAFIA

CORNELIUS, Marli Terezinha Frana. Apostila de aulas prticas de Bioqumica: 10 aula Caracterizao da enzima urease de soja. Cascavel, 2013. WIKIP DIA. Enzima. Disponvel em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima>. Acesso em: 22 de maio de 2013.