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Sin embargo, dejan intactos organelos, como ncleos, mitocondrias, el complejo de Golgi, lisosomas, peroxisomas. Un homogeneizado o extracto contiene la suspensin de clulas, variedad de membranas, organelos, cada uno con distintos, tamao, carga y densidad. Como el medio de homogeneizacin ha sido cuidadosamente elegido, los componentes, incluyendo las vesculas procedentes del retculo endoplasmtico, (microsomas) conservan la mayor parte de sus propiedades bioqumicas originales.
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La ultracentrfuga preparativa
La muestra se coloca en los tubos que se insertan en un anillo de agujeros cilndricos en un rotor de metal. La rpida rotacin del rotor genera enormes fuerzas centrfugas, que hacen que las partculas en la muestra se sedimente.
El vaco reduce la friccin, impide que el rotor se caliente, y permite que el sistema de refrigeracin mantenga la muestra a 4 C.
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La ultracentrfuga preparativa
velocidad media 20.000 veces la gravedad durante 20 minutos. mitocondrias, lisosoma, peroxisoma
alta velocidad 80.000 veces la gravedad por 1 hora. Microsomas, pequeas vesculas. 150.000 veces la gravedad por 3 horas. Ribosomas, virus, macromolculas 7
Todas estas fracciones son impuras, pero muchos de los contaminantes pueden ser removidos al resuspender el precipitado y repetir el procedimiento de centrifugacin en varias ocasiones. La centrifugacin es el primer paso en la mayora de fraccionamientos, pero slo separa los componentes que difieren mucho en tamao.
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Para estabilizar las bandas sedimentadas el tubo contiene un gradiente continuo de sacarosa poco profundas que los aumentan en concentracin hacia la parte inferior del tubo (normalmente del 5% al 20% de sacarosa).
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Despus de la centrifugacin, los diferentes componentes se pueden recoger de forma individual, la mayora con slo pinchar el tubo de centrfuga de plstico y recoger las gotas de la parte inferior.
En la sedimentacin de equilibrio los componentes subcelulares se desplazan hacia arriba o hacia abajo cuando se centrifuga en un gradiente hasta alcanzar una posicin en la que su densidad es igual con su entorno. Los gradientes ms densos, que son tiles para la separacin de protena y cidos nucleicos, se puede formar a partir de cloruro de cesio.
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Este mtodo tambin funciona bien para la separacin de los lisosomas, las mitocondrias y peroxisomas en la fraccin inicial mixta obtenida por centrifugacin diferencial.
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Gran cantidad de solvente es bombeada lentamente a travs de la columna y se recoge en tubos separados. Debido a los diversos componentes del recorrido de la muestra a diferentes velocidades a travs de la columna, se fraccionan en diferentes tubos.
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Las protenas son a menudo fraccionados por cromatografa en columna, en la que se pasa una mezcla de protenas en solucin a travs de una columna que contiene una matriz slida y porosa.
Las protenas son retrasados, por su interaccin con la matriz, y pueden ser recogidos por separado.
Dependiendo de la matriz, las protenas se pueden separar en funcin de su carga (cromatografa de intercambio inico), su hidrofobicidad (cromatografa hidrofbica), su tamao (cromatografa de gel filtracin), o su capacidad de ligarse a determinadas molculas pequeas o con otros macromolculas (cromatografa de afinidad), HPLC.
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Este flujo osmtico causa que las clulas se hinchen y se rompen con facilidad.
En una solucin hipertnica (concentracin de sal mayor que la de interior de la clula), el agua fluye fuera de las clulas, causando que se encojan.
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Cuando las clulas se colocan en una solucin isotnica (concentracin de sal igual a la del interior de la clula), no hay movimiento neto de agua dentro o fuera de las clulas. Por esta razn, una solucin isotnica es lo mejor para preservar la estructura de la clula normal.
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