mikrovili

DNA
D E O K S R B O N K L E K A S T

Hayvan Hcresi
Bitki, hayvan bakteri hi fark etmez hepsinin iinde DNA vardr. Tm canllar onun sayesinde protein retir, byr ve oalr.

sitoplazma lizozom hcre zar mitokondrial kristalar

Deoksiribonkleik asit, DNA, hcrelerin bilgi deposudur. Bir hcreyi ya da organizmay oluturmak iin gerekli tm bilgileri ierir. Dier pek ok iletiim sisteminde olduu gibi bu bilgiler de kodlanm olarak tanr. DNAnn yap talar nkleotid denilen molekllerdir. Nkleotidler blmden oluur: Bir fosfat grubu, be karbonu bulunan bir eker ve bir organik baz (adenin, guanin, sitozin ya da timin). Nkleotidin eker parasndaki karbonlar, baz ve fosfat gruplarnn balanmas iin gereklidir. Bu ekerin 1' numaral karbonu baz moleklyle, 5' ucundaki grubuysa fosfatla balanr. Bylece oluan nkleotidler birbirleriyle zel bir ekilde birleerek, polinkleotid zincirlerini olutururlar. Bu birlemede her zaman ilk nkleotidin ekerinin 3' grubuyla, buna eklenecek nkleotidin 5' ucunda bulunan fosfat grubu birleir. Bu nedenle polinkleotid zincirleri belli bir yne sahip olur (5' dan 3' a doru). DNA molekl, iki polinkleotid zincirinin birbirine sarlmasyla oluur. eker ve fosfattan oluan iskelet bu ikili sarmaln d blmn olutururken, bazlar da sarmaln i blgesinde birbirleriyle karlkl olarak birleirler. Bu baz iftleri, sarmalda birbiri zerine gelen paralel dzlemler olutururlar. Sarmal oluturan polinkleotid zincirlerinin ynleri zttr; birinin 5' ucu, dierinin 3' ucuyla ayn yndedir. Bu iki zincir, hidrofobik etkileimlere ek olarak, karlkl dizilmi bazlar arasnda oluan hidrojen balar sayesinde bir arada tutulur. Adenin (A) her zaman timinle (T) birleir ve aralarnda 2 hidrojen ba kurulur; guaninse (G) sitozinle (C) birleir ve aralarnda 3 hidrojen ba kurulur.

adenin timin koful ekirdekik ekirdek zar

ekirdek R-endoplazmik retikulum

mikroflament ekirdek zar delii

ribozom sitozin sentriyol guanin mitokondri eker-fosfat iskeleti mikrotbl

peroksizom

pinositotik ara S-endoplazmik retikulum salnm blgesi nkleoplazma golgi aygt

DNAnn Farkl Formu

DNAy oluturan polinkleotid zincirleri ya sa ya da sol vida ynnde dnen sarmallar olutururlar. eker-fosfat iskeletinin yapsnn geometrisi bunlardan birincisine daha ok uyar. Bu yzden normal DNA, sa sarmal ynndedir. DNAnn bu haline B-DNA denir. B-DNAda ikili sarmaln st ste gelen baz iftlerinin aras 0.34 nmdir. Sarmaln tam bir dnne karlk gelen admysa 3.4 nmdir, yani B-DNAda her dnte 10 baz bulunur. Bu formdaki DNAda sarmaln d ksmnda dzenli olarak sralanm bir byk bir kk girinti vardr. Bylece buralara DNAnn ilevini yapabilmesi iin gereken molekller balanabilir. Yine sa sarmal yapsnda olan A-DNA, B-DNAya gre biraz daha skk bir molekldr. Sarmaln adm 2.3 nmdir ve 11 baz ierir. DNA baz ortamlarda bu formda bulunabiliyor. Z-DNA sol vida ynnde yaplanm bir sarmaldr. Burada bazlar zikzak izmi gibi grnrler. Bu formun doada bulunup bulunmad henz bilinmiyor. Bu formda sarmallar iki yerine bir derin girinti oluturuyor.
TBTAK

B-DNA

A-DNA

DNAnn Farkl Formlarnn Boyutlu Modelleri

Z-DNA

Bilgisayar ortamnda yaratlan bu modellerde, DNAy oluturan bazlar farkl renklerle gsteriliyor. Adenin-krmz, timin-sar, sitozin-mavi ve guanin-yeil. Bu bazlar yandan gsterilen modellerde renkli dzlemler olutururken, tepeden gsterilen modellerin i ksmnda yer alyor.

Genetik Mhendislii
ACGT ACGT ACGT ACGT ACGT

DNA Molekl
DNA, iki zincirin oluturduu sarmal biiminde bir molekldr. i karlkl olarak elemi drt bazdan, dysa eker-fosfat iskeletinden oluur. Karlkl zincirlerdeki bazlar birbirlerine hidrojen balaryla balanrlar. Adenin (A) daima timinle (T), guanin de (G) sitozinle (C) ba yapar. Bu molekllerin
5' ucu 3' ucu

Rekombinant (melez) DNA Paralarnn Hazrlanmas

EcoRI
5' vektr DNAs 5'

EcoRI
3'

Virs Vektrlerinde Klonlama

nsan DNA paralar Cos

EcoRI

Cos

3'

3'

5'

3'

5'

EcoRI

EcoRI

5'

3'

EcoRI ile kesim sonucu oluan tek zincirli DNA paralar

5'

3'

3'

5'

3'

5'

Genetik mhendislii, canllarn genetik materyalinin, DNA kodunun, deitirilmesini, organizma iinde ya da farkl organizmalar arasnda nakledilmesini salayan teknikleri aklamak in kullanlan bir terimdir. Btn canllar hcrelerinde DNA tarlar. Bu nedenle sz konusu teknoloji, tr ne olursa olsun herhangi bir canl zerinde uygulanabilir. Yalnzca tarm ve hayvanclkta deil, tp alannda da yeni seenekler sunan genetik mhendislii, bozuk genleri dzeltme, bir organizmada normalde bulunan bir zellii daha da gelitirme, hastalk ya da evresel etkilere kar direnci arttrma ya da bir organizmaya normalde yapamad bir ii yaptrma gibi amalarla kullanlyor. Bu teknolojide kullanlan temel yntem, istenilen genin ok miktarda retilebilmesini salayan molekler klonlamadr. Bu yntemde oaltlacak gen, vektr ad

Tamamlayc baz elemesi

5' 3'

3'

5'

DNA ligaz yardmyla birleme

5'
eker

3'

Rekombinant molekl
3' 5'

eker

eker

eker 3' ucu 5' ucu

verilen ve kendini kopyalayabilme zellii olan baka bir DNA moleklne birletirilir. Bylece oluan rekombinant molekl uygun bir tayc hcreye sokularak oaltlr. Molekler klonlama, genlerin daha detayl karakterizasyonunu ya da gen rnlerinin ok miktarda retilebilmesini olanakl klar.Bu posterde genetik mhendisliinin baz temel tekniklerini sunuyoruz.
Plazmid Vektrnde Klonlama
Plazmid vektrleri, virs vektrlerine gre, klonlanan DNAnn daha kolay kullanlabilmesi olanan sunar. Plazmidler, kk dairesel DNA paralardr. Bunlar bakterilere sokulduklarnda kendi balarna oalabilirler. Bakteriden bamsz oalmalarn salayacak gen parasnn (ori) yan sra, bir antibiyotik direnlilik geni (burada ampisilin direnlilik geni, Ampr ), bir de restriksiyon enzimi kesim blgeleri ierirler. Klonlanmak istenilen DNA paras bu vektre yerletirilir. Elde edilen vektr bakteriye sokulur. Bakteri, iinde antibiyotik bulunan ortamda oaltlr ve bylece sadece bu plazmidi, dolaysyla DNA parasn, tayan bakterilerin bymesi salanr. Oluan her bir koloni izole edilip retilerek, klonlanm DNA parasndan byk miktarda elde edilir.
Klonlanacak DNA paralar DNA paras

dizilimlerini ve ikili ve l ba yaplarn gryorsunuz.

Rekombinant bir DNA molekl oluturmak iin kullanlacak DNA paralar, genellikle restriksiyon enzimleri kullanlarak elde edilir. Bu enzimlerin ou kesim yaptklar blgede tek zincirden oluan bir DNA paras olutururlar. ki farkl DNA moleklnn bu birbirini tamamlayan tek zincirleri, karlkl bazlarn elemesi yoluyla birleir. Bu birleme, DNA iplerindeki krklar birletiren DNA ligaz enzimiyle salamlatrlr.

Bakteriyofaj , bakterileri EcoRI ile kesim ve birleme doal olarak enfekte edebilen bir virstr. Bu Cos Cos virs kullanlarak oluturulan vektrde, virsn oalmas Rekombinant molekln iin gerekmeyen genler virs klfna sokulmas Rekombinant karlarak, bunlarn yerine virsler restriksiyon enzim blgeleri yerletirilir. Yaklak 15 kilobaz (kb) byklnde DNA paralarn tayabilme kapasitesi olan bu E. colinin virs tarafndan vektrlerin rettii enfekte edilmesi rekombinant molekller, Bakteri katman virs klflar iine de Her rekombinant virs tek sokulabilir. vektrnde iki bir plak oluturur. Virs pla nemli blge vardr. Bunlardan ilki klonlanmak istenilen genin sokulaca restriksiyon enzimi kesim blgesidir. (Burada EcoRI denilen bir enzimin kesim blgesi bulunuyor.) kincisi de, vektrn her iki ucunda bulunan ve "cos" denilen blgedir. Bu ular, DNA parasnn vektr klfna sokulmas iin gerekir. Klonlanacak DNA (burada insan DNAs) restriksiyon enzimiyle kk paralara ayrlr. Vektr de bu enzimle kesilerek, insan DNAsnn herhangi bir parasyla birleir ve virs klfna sokulur. Daha sonra bu virsler, koli basili olarak bilinen Escherichia coli yi enfekte etmek iin kullanlr. Bakteri kltr ortamnda oluan her bir virs pla, insan DNA paralarndan sadece birini tar. nsan DNAsndan karlmak istenilen zel DNA parasnn oluturduu plak, zel teknikler kullanlarak dier plaklar arasndan kolayca seilebilir. Daha sonra da, ayr olarak istenildii kadar oaltlabilir.

vektr

Kozmid Vektrnde Klonlama

Kozmid vektrler hem virs vektr gibi cos blgesi ieren, hem de plazmid vektrler gibi ori ve antibiyotik direnlilii genlerini ieren DNA moleklleridir. Bu sayede, vektrnde olduu gibi rekombinant molekl virs paralarna sokulabilir ve plazmid vektrnde olduu gibi bakteride oaltlp seilebilir. Kozmid vektrler, yaklak 45 kb byklnde DNAy tayabilirler.
BamHI

Polimeraz Zincir Reaksiyonu, PCR

Molekler klonlama, DNA paralarnn bakterilerde olatlmasn salar. DNA molekllerinin oaltlabilecei bir baka yol da, 1988de Kary Mullisin gelitirdii polimeraz zincir reaksiyonu, PCR, yntemidir. oaltlmak istenilen DNA parasnn bir ksmnn dizilimi bilindiinde, PCR sayesinde bu DNA paras tmyle laboratuvar koullarnda ok fazla miktarda elde edilebilir. DNA molekllerinin says her evrimde bir ncekinin iki katna kar. Tek bir DNA molekl 30 evrim sonunda yaklak bir milyar tane olur. Bu yntem sayesinde balang iin ok az miktarda DNA yeterli olur. oaltlmak istenilen DNA stlarak, iki ziciri birbirinden ayrlr. Daha sonra soutularak 15 - 20 bazlk yapay DNA paralaryla (primerler) birlemesi salanr. Taq polimeraz denilen zel bir enzim yardmyla, primerlerden balayarak yeni DNA zincirleri sentezlenir. Sonuta, bir evrim sonunda ilkinin ayn iki DNA molekl elde edilmi olur.
Balang DNAs
5' 3'

Sanger Yntemiyle DNA Nkleotid Diziliminin Belirlenmesi

Dideoksinkleotidler, deoksinkleotidlerdeki gibi 2'-OH gruplar yannda ayrca, 3'-OH gruplarn da kaybetmi nkleotidlerdir. Bu nkleotidler, sentezlenmekte olan DNAya rahata balanabilirler. Ancak 3'-OH gruplar olmad iin, DNA sentezi srasnda bir sonraki nkleotid bunlara balanamaz ve sentez sona erer. DNAnn nkleotid dizilimi belirlenecei zaman, DNA sentezi radyoaktif olarak iaretlenmi bir primer ile balatlr. Drt farkl reaksiyon yrtlr. Bunlarn her birinde bir tip dideoksinkleotid ve dier normal deoksiribonkleotidler kullanlr. Dideoksinkleotid sentezlenen DNAya eklendii zaman, DNA sentezi durur. Bu durumda her bir reaksiyon, radyoaktif primerle balayp, dideoksinkleotidle biten bir seri DNA molekl oluturur. Bu drt reaksiyonun rnleri otoradyografiyle incelenerek, DNAnn nkleotid dizilimi belirlenir.

Yabanc gen rnnn bakteri tarafndan retilmesi

Yabanc genlerin rnlerinin bakteride retilmesi amacyla "ekspresyon" vektrleri kullanlr. Bu vektrler, rn istenilen DNAnn yannda, bu DNAnn bakteri tarafndan kullanlabilmesi iin gereken baz zel DNA paralarn da tarlar. (Burada promotr, pro). Ayrca bu vektrler, DNAdaki bilgiyi ribozomlara tayacak olan RNAnn, proteini sentezleyen ribozomlara balanmasn salayacak Shine-Delgarno (SD) denilen bir blgeyi de tarlar. Bu vektrler bakteriye sokulduunda, iindeki gen bakteri tarafndan kullanlr ve DNAda belirtilen protein retilir.
Bakteri promotr ve ribozom balanma dizilimi
pro SD

EcoRI

EcoRI ile kesim ve birleme

Ampr

Rekombinant plazmid

3' 5' Radyoaktif primer 3'

5'

3'

5'

ori Ampr
Plazmid vektr

Amp

Kozmid vektr

cos
5'

950 Cde stlarak DNAnn zincirliri birbirinden ayrlr

3'

Dideoksinkleotidlerin de bulunduu ortamda DNA sentezi

E. coliye rekombinant plazmidin aktarlmas

DNA paras

Ampr

Ekspresyon vektr

ori

ori BamHIla kesilen ve virse sokulan DNA paras

3' 5'

ori
karyotik cDNAnn vektre sokulmas
3'
pro SD

55 Cde primerler tek DNA zincirlerine balanr

0

5'

Bakterinin ampisilin ieren kltr ortamnda bytlmesi

cos cos

cDNA Primer 2
5' 3' 3' 5'

Primer 1

Elektroforez ve otoradyografi

Ampr
5'

Ampisiline direnli bakteri kolonileri

Ampisilin ieren kltr ortam

E. colilerin rekombinant virsle enfekte edilmesi ve antibiyotik direnli kolonilerin seilmesi

cos

3'

zole edilecek koloni

72 Cde Taq polimeraz enzimiyle yeni DNA zincirleri sentezlenir

0

DNA paralarnn gidi yn

3' 5'

ori
Kar zincirin nkleotid dizilimi vektrn E. coliye aktarlmas

5' 3'

3' 5'

5' 3'

E. coli DNAs
Rekombinant plazmidi tayan bakteriler
TBTAK

ori Amp

2 yeni DNA molekl

r

Kozmid DNA dairesel bir yap alr ve byk bir plazmid olarak oalr.

2 yeni DNA molekl

2 yeni DNA molekl

karyotik proteinin retilmesi

mRNA Protein