Tcnicas de Siembra y Aislamiento de Bacterias.

Las tcnicas generales de siembra incluyen la inoculacin de medios lquidos y la siembra de medios solidos ya sea en tubos o cajas de petri. Los inculos pueden provenir a su vez de medios solidos de tubo o placa o de un cultivo lquido, tambin puede provenir de muestras biolgicas o ambientales solidas o liquidas. Los instrumentos de siembra habitualmente usados son: Asa de siembra. Hilo de siembra. Esptula de drigalsky Para sembrar cualquier medio de cultivo hay que adoptar condiciones de asepsia tanto para tomar el inoculo como para depositarlo en el medio, estas condiciones implican: 1. Flamear el asa o el hilo de siembra. 2. Flamear la boca del tubo, matraz o frasco. 3. Manipulacin de las cajas de petri. 4. Rotulado del material.

Inoculacin en medio lquido. 1. El inoculo se tomara de una placa de petri. 2. Flamear el asa, dejarla enfriar, destapar la placa, tomar el inoculo y volver a tapar la placa. 3. Tomar de la gradilla el tubo a inocular, destaparlo y flamear la boca del mismo. 4. Re-suspender el inoculo con el asa, descargando el asa contra la pared del tubo, inclinndolo verticalmente. 5. Flamear la boca del tubo, colocar el tapn y colocarlo en la gradilla. 6. Flamear el asa y esperar a que se enfri antes de depositarla sobre la base del mechero.

Siembra en Agar Inclinado. 1. El inoculo se tomara de un medio lquido. 2. Tomar el tubo de la gradilla y agitarlo para homogeneizar el cultivo. 3. Flamear el asa, dejarla enfriar, destapar el tubo con el cultivo y flamear la boca. 4. Introducir el asa y tomar el inoculo, flamear la boca del tubo, taparlo y depositarlo en la gradilla. 5. Tomar de la gradilla el tubo a inocular, destaparlo y flamear la boca del mismo. 6. Introducir el asa y realizar tantas estras como se pueda sobre la superficie del agar comenzando desde el fondo hasta la parte de arriba del tubo ya que no se trata de aislar colonias sino de obtener masa bacteriana. 7. Flamear la boca del tubo, colocar el tapn y depositarlo en la gradilla. 8. Flamear el asa y esperar a que se enfri, antes de depositarla sobre la base del mechero.

Procedimiento para Sembrar un Tubo en Picadura. 1. El inoculo se tomara de medio solido en tubo de agar inclinado. 2. Flamear el asa, dejarla enfriar, destapar el tubo con el cultivo y flamear la boca. 3. Introducir el hilo y tomar el inoculo, flamear la boca del tubo, taparlo y depositarlo en la gradilla 4. Tomar de la gradilla el tubo a inocular, destaparlo y flamear la boca del mismo. 5. Introducir el hilo en posicin vertical en el medio de cultivo, debe entrar solo el hilo no el resto, sacar el hilo con cuidado procurando que salga por donde entro. 6. Flamear la boca del tubo, colocar el tapn y depositarlo en la gradilla. 7. Flamear el hilo y esperar a que se enfri antes de depositar sobre el mechero.

Siembra en Placa de Petri. Tiene como objetivo la obtencin de colonias aisladas. El separamiento consiste en la separacin de un determinado microorganismo de las poblaciones mixtas existentes en la naturaleza, para lgralo es necesario: Hacer estras muy juntas, avanzando suavemente por la superficie del agar sin retroceder. Para evitar que el asa se clave en el agar es necesario colocarla lo ms paralelamente posible a la superficie del medio. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras para diluir la muestra de manera que si bien, las primeras aparecer un crecimiento confluente o masa contina de microorganismos. En las estras finales se podrn obtener colonias perfectamente separadas unas de otras. Procedimiento. 1. El inoculo se tomara del medio lquido. 2. Tomar el tubo de la gradilla y agitar para homogenizar el cultivo. 3. Flamear el asa, destapar el tubo con el cultivo y flamear la boca. 4. Introducir el asa y tomar el inoculo, flamear la boca del tubo, taparlo y depositarlo en la gradilla. 5. Con la placa en posicin invertida, cerca del mechero tomar la base de la placa con la mano contraria a la que lleva el asa. Estras Continuas. Estras de un extremo al otro de la placa. Para hacer un buen aislamiento por este mtodo hay que hacer muchas estras y muy juntas como se pueda en la primera parte de la siembra en la mitad de la placa, en la otra mitad las estras se van separando a medida que vamos teniendo menos inoculo en el asa.

 Para hacer ms cmoda la siembra en la segunda mitad de la placa podemos levantar el asa y girar la placa 180 grados sembrando bien desde el centro de la placa hasta el final o bien empezando por el extremo y terminando en el centro sin tocar las primeras estras.

Estras por Cuadrantes. Antes de proceder a la siembra conviene dibujar con el rotulador dos lneas perpendiculares en la base de la placa, opcionalmente se pueden numerar los cuadrantes siguiendo el sentido de las agujas del reloj. Para sembrar el primero de ellos se procede como si se estuviera haciendo una siembra por estra continua teniendo especial cuidado de no salirse de los mrgenes establecidos por las lneas. Una vez finalizado el primer cuadrante, se flamea el asa para eliminar el resto del inoculo que quede en el medio. Cuando el asa este fra se arrastra por encima del extremo de las estras y se procede a separar el cuadrante dos. Se repite la misma operacin en los cuadrantes tres y cuatro, tomando el inoculo en cada caso de las estras previamente realizadas en el cuadrante inmediatamente anterior.

Estras cada 45 grados. Este procedimiento es muy similar al anterior aunque en lugar de los cuadrantes se hacen estras paralelas. Cada grupo de estras se hace con ngulo de 45 grados aproximadamente con respecto a la anterior. Entre grupo y grupo de estras se flamea el asa, al final se realiza una siembra por agotamiento en el centro de la placa para aprovechar toda la superficie del agar. Flamear el asa y esperar a que se enfri antes de depositar sobre la base del mechero.

Siembra en Placa con Esptula. Se realiza por extensin del cultivo bacteriano sobre la placa de petri con la esptula de drigalsky. Si la esptula es de vidrio o de metal se esteriliza previamente antes de extender la muestra. Para ello se sumerge en alcohol y se escurre para pasar por la llama del mechero, el proceso se repite dos o tres veces. Por ltimo se espera a que se enfri antes de utilizar, cuando la esptula es de un solo uso no es necesario hacer esta operacin. Trabajando siempre alrededor del mechero y con ayuda de una micropipeta se toma 0.1 mililitros de cultivo y se depositan en el centro de una placa de petri que se coloca hacia abajo, no en posicin invertida. Con la ayuda de la esptula se extender el cultivo sobre la superficie de la placa girando con la mano que nos queda libre y sosteniendo a su vez la tapadera para evitar la contaminacin de la placa. Una vez absorbido todo el lquido podremos ahora si poner la placa en posicin invertida.