ESTIMACION DE LA VIABILIDAD DEL POLEN INTRODUCCION La calidad del polen es de gran importancia en las investigaciones relacionadas con la reproduccin

sexual, pues permiten asegurar el xito de las hibridaciones e incrementar la eficiencia del mejoramiento. El medio ambiente en condiciones adversas puede afectar la viabilidad del polen limitando la produccin de la semilla botnica. El estrs de calor y frio provocan una disminucin de la cantidad y calidad del polen, lo que puede ser ocasionado por una menor cantidad de nutrientes presentes en la antera, as como una reduccin importante en el nmero de granos formados como consecuencia del elevado porcentaje de aborto de clulas madre de polen y de microsporas en diferentes etapas de su formacin. OBJETIVOS Familiarizar con la tcnica de determinacin de la viabilidad de los granos de polen Reconocer las partes del grano de polen Diferenciar morfolgicamente los granos de polen de las especies utilizadas en la prctica Determinar la viabilidad del polen de la muestra por el mtodo de tincin. REVISION BIBLIOGRAFICA EL POLEN Es el elemento germinal masculino, producido en las anteras de las flores, indispensable para la fecundacin y consiguiente transformacin de la flor en fruto. a) Caractersticas organolpticas: Se presenta como un polvo cuyo color vara en relacin con la especie de que procede, siendo generalmente amarillo o caf claro, aunque tambin se puede encontrar blanco, rosado, anaranjado, verde, rojizo, violceo e incluso negro. Es ms difcil de observar sobre las flores que el nctar. Al igual que el color de los plenes, el sabor y olor de los mismos son tambin variables segn su procedencia. El sabor vara desde el dulce al amargo. El olor resulta caracterstico de cada flor, independiente del de sus ptalos o del polen de otro tipo de flores. b) Constitucin: Los granos de polen estn constituidos por una sola clula provista de una pared muy compleja denominada esporodermis, la cual por su estructura y composicin qumica es idntica a la de las esporas de los Pteridfitos. Esta pared polnica o esporodermis, consta de dos capas concntricas: en el interior, la intina, delicada, celuloso-pctica, que envuleve de forma continua al protoplasto; en el exterior, la exina, gruesa, constituida por esporopolenina, siendo sta una de las sustancias vegetales conocidas ms resistente a los agentes qumicos y degradaciones enzimticas.

Fig. 1. Esquema de un grano de polen binucleado.

En el 70% de las Angiospermas, la pared polnica rodea y protege a dos ncleos (plenes binucleados), los cuales difieren entre s desde un principio en el aspecto y en el tamao. Posteriormente tambin en su funcionamiento. Uno, el ms grande y redondeado, con vacuolas y reservas, no interviene en los fenmenos sexuales propiamente tal, desempeando un papel nutricional para los ncleos generativos e interviniendo en la formacin de la pared del tubo polnico cuando el grano de polen germina. Es el llamado ncleo vegetativo. El otro, ncleo reproductor o generativo, ms pequeo y alargado en forma de media luna, carente de vacuolas y reservas, interviene directamente en la fecundacin (Figura N2). Para ello, y en un estado ms o menos avanzado de germinacin del grano de polen o lo que es lo mismo ya claramente producido el tubo polnico, originar dos ncleos generativos los cuales llevarn a cabo la fecundacin en el primordio seminal, que, como es sabido, en las Angiospermas es doble. Un ncleo generativo se fusiona con la ovoclula y el otro con los ncleos que ocupan la parte central del primordio seminal (ncleos polares) (Figura N3). Fig. 2. Esquema de los estados de germinacin del grano de polen y desarrollo del tubo polnico.

En el 30% restante de las Angiospermas nos encontramos con granos de polen trinucleados: Familias como Apiaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Apocynaceae, Caprifoliaceae, Rubiaceae, etc., poseen un polen de este tipo. Cada grano tiene un ncleo vegetativo y dos generativos c) Formacin: El grano de polen se forma en el tejido esporgeno de los sacos polnicos, por meiosis de las clulas madres del polen. Cada una origina cuatro granos de polen. Las cuatro clulas haploides resultantes, forman en el interior de la clula madre una ttrada hasta su

maduracin (en las Angiospermas Monocotiledneas las cuatro clulas se disponen en un mismo plano y no en tetraedros como en las Angiospermas Dicotiledneas). Estas clulas haploides se redondean, elaboran su propia pared y, degenerndose la de la clula madre primitiva, quedan libres. Posteriormente se transformarn cada una en un grano de polen, para lo cual engrosan su pared, diferencindola en dos capas: una externa o exina y una interna o intina; esta ltima originada posteriormente a la primera. Asimismo, estas clulas o microsporas se dividen mitoticamente de una manera desigual en el interior de su envoltura, formndose as dos ncleos, el ncleo vegetativo grande y otro pequeo y fusiforme, que es el ncleo reproductor generativo. Este ltimo puede quedar, o no, en una posicin excntrica. Los granos de polen as formados se deshidratan parcialmente y entran en vida ralentizada. Estn listos para ser diseminados, lo cual se producir con la desecacin de la antera. Por lo general, son liberados por separado (mnadas o plenes libres), aunque en algunos txones se libera la ttrada entera (plenes compuestos), o incluso se libera el saco polnico entero, formando poliadas. d) Polaridad: La ttrada juega un papel importante, pues ella es responsable de la disposicin del grano de polen, de su polaridad y, por ende, de su forma, as como tambin de la situacin de las aperturas. En cuanto a la polaridad, cada grano de polen presenta un rea proximal que corresponde a la zona ms cercana al centro de la ttrada y una zona distal que corresponde al lado externo opuesto. El centro de cada una de las zonas se denomina polo, habiendo por tanto un polo proximal y otro distal. La lnea imaginaria que une ambos polos se denomina eje polar. Adems existe otra lnea perpendicular al eje polar por el ecuador, llamada eje ecuatorial o dimetro ecuatorial. Fig. 4. Dibujo de un grano de polen

Segn su polaridad, se denomina apolar al polen en el que una vez liberado de la ttrada no pueden reconocerse las zonas polares, y polar al que presenta dos zonas polares ms o menos bien definidas. En este ltimo caso es isopolar, el polen cuyas zonas polares son semejantes, lo

que ocurre normalmente, y heteropolar el que las presenta diferentes; se denomina subisopolar al que tiene zonas polares ligeramente diferentes (Valds, 1987). Segn Valds (1987), los granos de polen pueden ser simtricos o asimtricos y segn la polaridad de los mismos se pueden distinguir los cinco modelos siguientes: Polen isopolar radiosimtrico: con un plano horizontal y dos o ms planos verticales de simetra de igual dimensin. Polen heteropolar radiosimtrico: sin plano horizontal de simetra. Polen isopolar bilateral: con tres planos de simetra, uno horizontal y dos verticales, los ltimos de distintas dimensiones, por lo que se reconocen dos dimetros ecuatoriales. Polen heteropolar bilateral: con dos planos de simetra, ambos verticales y de distintas dimensiones. Polen asimtrico: con ningn plano de simetra, pueden ser tanto apolares como heteropolares.

e) Morfologa: Se podra considerar a los granos de polen como pequeas esferas, pero la realidad es que pronto se deforman debido a la discontinuidad fsica de la pared que los recubre (sistema apertural) y a la accin del medio (natural o artificial) que los rodea, por lo general causante de turgencias y plasmlisis que el mecanismo harmomegtico de los granos (las aperturas permiten cambios de volumen para la acomodacin del polen a distintos grados de humedad = harmomegatia) no puede neutralizar. Debido a que la forma del grano de polen est sometida a cambios, y siendo un carcter importante en los estudios polnicos, los palinlogos acordaron referir la misma a granos acetolizados en evitacin de desuniformidades en las descripciones palinolgicas, y considerar al menos dos formas observadas al microscopio ptico: una en vista polar (corte ptico ecuatorial), cuando el haz luminoso es paralelo al eje polar; y otra, en vista ecuatorial (corte ptico meridiano), cuando ste es perpendicular. Segn Valds (1987), la forma del polen se define de dos maneras: utilizando la razn de los ejes polar y ecuatorial (P/E) y describiendo el contorno del mismo, tanto en visin polar, como ecuatorial. Pero para razones de este trabajo slo nos referiremos al primer criterio de clasificacin en cuanto a la forma del polen, porque sta fue utilizada en la descripcin de ellos y adems se agrega, ms adelante, un segundo criterio de seleccin del autor Calvin Heusser, que tambin fue utilizada. Para Valds (1987), segn la razn P/E, pueden distinguirse nueve tipos de plenes:

La forma del polen es el primer criterio de identificacin, y los reconoce como se presenta a continuacin: Los plenes bilateralmente simtricos son clasificados como: Plano-convexo, concavoconvexo y biconvexo. Cuando son mirados lateralmente o ecuatorialmente, y son generalmente elpticos en vista polar. Los tipos radiosimtricos caen dentro de varias clases, dependiendo de los radios de sus ejes polares y ecuatoriales, de ah la razn P/E. El amb (contorno del polen en vista polar) de granos de polen radiosimtricos es: circular, triangular y poligonal o representado por alguna modificacin de estas formas.

f) Tamao y cantidad: Segn la longitud del eje ms largo, se pueden distinguir seis grupos de plenes, que se indican en la tabla N 5. En cuanto al nmero de granos de polen que originan las anteras se puede decir que es muy variable y, por lo general, muy elevado. Tabla N5: Tipos de plenes segn longitud del eje mayor (Observacin: no siempre el eje polar coincide con el eje mayor)

g) Estructura: Las capas que rodean y protegen los granos de polen constan de dos complejos de estratos, ya indicados anteriormente, la exina y la intina. La intina envuelve al protoplasto sin solucin de continuidad, suele ser delicada y qumicamente poco resistente. Muchas veces se observan en ella dos o tres estratos, de los cuales el ms externo contiene a menudo, abundante pectina que facilita la separacin entre intina y exina; en el estrato interior o medio los elementos fundamentales son fibrillas de celulosa. Al germinar el grano de polen, solamente la intina se desarrolla para dar el tubo polnico. La intina junto con el contenido celular, es eliminada por el procedimiento acetoltico, quedando exclusivamente la exina, en la que estudian los caracteres necesarios para diferenciar a unos txones de otros. Por lo tanto, uno de los objetivos principales en los estudios palinolgicos radica en la exina. La exina, como ya fue indicado, est constituida esencialmente por esporopoleninas, qumicamente muy resistentes y degradables slo por oxidacin. Se trata de terpenos, los

cuales parece ser que se originan por polimerizacin oxidativa de carotenoides o steres de los mismos . En general, en la mayora de las Angiospermas la exina est formada por un conjunto de elementos radiales, llamados columelas o bculos, que pueden soportar una estructura continua o perforada denominada tctum y cuyas bases siempre se funden formando un soporte comn (Valds, 1987). Tiendo con fucsina bsica se observan dos capas con distintas apariencias de colorante, un estrato superior o capa basal (foot-layer) y una capa inferior, menos densa a la luz y denominada endexina.

Fig. 5. Esquema de los componentes de la exina.

La estructura segn Heusser (1971), puede ser: Tectada: cuando los granos de polen poseen un tctum sobre la mayor parte de la superficie. Intectada: cuando existe ausencia de un tctum, esto es, sin una escultura de ectexina fusionada que forma una membrana o tctum por fuera de la endexina. Semitectada: cuando el tctum est desarrollado slo parcialmente sobre el grano de polen, por lo tanto, es transicional entre tectada e intectada.

h) Escultura: Los trminos ornamentacin y escultura del grano de polen son sinnimos, siendo empleados indistintamente por muchos autores. Estos trminos se refieren nicamente a los caracteres geomtricos externos de la exina, la superficie del tctum y los elementos supratectales, no considerando la estructura interna. La ornamentacin del grano de polen es enormemente variada. A continuacin se indican los tipos de escultura ms frecuentes segn Heusser (1971): Baculada: Tipo de escultura que consiste en baculas.

Clavada: Tipo de escultura que expone clavas o elementos en forma de garrotes. Echinada: Tipo de escultura con punteado de por lo menos 1 de altura. Sus componentes son llamados echinis. Estriada: Tipo de escultura que consiste en lomas paralelas, llamadas vallas, y estras. Fossulada: Tipo de escultura ranurada o surcada. Foveolada: Tipo de escultura donde los pits son por lo menos de 1 de dimetro. Estos pits se denominan foveas. Gemmada: Tipo de escultura consistente en gemmas. Psilada: Tipo de escultura que posee una superficie lisa o con pits menores a 1 en tamao. Reticulada: Escultura que expone un diseo de red o de retculo. Esta puede ser homobrochada cuando los brochis del retculo son uniformes en tamao o heterobrochada cuando los brochis del retculo no son uniformes en tamao. Rugulada: Tipo de escultura que contiene rugulas. Scabrada: Tipo de escultura con elementos menores a 1 de tamao y radialmente ms o menos isodiamtricas. Verrucada: Escultura que contiene verrucas.

i) Aperturas: Es uno de los caracteres prioritarios en la descripcin de los granos de polen. La exina est generalmente provista de reas adelgazadas o interrumpidas, por lo comn especialmente delimitadas, llamadas aperturas, las cuales son variables en nmero y posicin, as como en morfologa, que pueden permitir la salida del tubo polnico y la regulacin del volumen hdrico para la acomodacin del polen a distintos grados de humedad (harmomegatia). Algunos plenes carecen de aperturas, denominando a stos como inaperturados. Pero, por lo general, los plenes presentan de una a muchas aperturas, que bsicamente son de dos tipos: largas o colpus y cortas o poros. Los colpus son aperturas alargadas y paralelas al eje polar, y en la mayora de los casos recubiertas por una fina capa de exina. Esta fina capa es la llamada membrana del colpus. Suele ser elstica, lisa o con analoga con el resto del grano, aunque en este ltimo caso tendr menos relieve y slo se conservarn fragmentos. El nmero de colpus vara de 1 a 30, incluso ms. La presencia de un solo colpus es caracterstico de las Angiospermas Monocotiledneas. El nmero y disposicin de los colpus, cuando hay ms de uno, depende de la posicin y modo de formacin de los granos de polen en la ttrada, pues los colpus se forman sobre la superficie de contacto de un grano de polen con los otros granos hijos, en un estado inicial de su desarrollo. El colpus de los granos monocolpados se encuentra situado en la cara distal. En las Angiospermas Dicotiledneas lo frecuente es encontrarnos con granos tricolpados.

En los granos tricolpados, la longitud de los colpus, as como sus bordes y formas, son variables. En cuanto a lo primero, no llegan a los polos. El conjunto de los tres colpus slo es visible en visin polar. En visin ecuatorial slo uno o dos colpus sern visibles y el resto podrn ser observados por transparencia a travs del grano de polen. En los tetracolpados, los colpus estn en el ecuador a distancias iguales, pero en la mayor parte de los casos no siguen los meridianos, sino que pasan oblicuamente por el ecuador y se unen dos a dos en cuatro puntos formando ngulos de 120. Si las aperturas alargadas se disponen no paralelas al eje polar del grano de polen, sino que perpendiculares al mismo, se denominan sulcos, y si se encuentran en cualquier otra posicin, rugas. A veces, las aperturas se disponen en espiral (polen espiraperturado). Se denomina mesocolpia al rea delimitada por dos colpus adyacentes y al resto de la superficie como apocolpia. El grano de polen sincolpado, es aquel que presenta los colpus unidos en uno o ambos polos. En cuanto a los poros, que son orificios de la exina, son muy variables en nmero pudiendo oscilar desde uno en Poaceae a ms de cien en Chenopodiaceae. El nmero y forma, en general, se mantiene constante para un determinado grupo. La posicin de los poros est estrictamente determinada para una especie dada. En los granos monoporados, el poro se encuentra en posicin distal. Si los granos de polen tienen tres o ms poros, se disponen generalmente equidistantes en el ecuador. Cuando los granos de polen no slo tienen colpus, sino tambin poros (plenes colporados), estos se disponen normalmente en el centro. El rea delimitada por dos poros adyacentes se denomina mesoporia, y al resto de la superficie apoporia. En el plano, el poro se presenta generalmente como una abertura redondeada o ms o menos oval; esta abertura tiene un contorno doble por los diferentes niveles de la exina. La seccin mayor se ve por transparencia y corresponde al contorno exterior; el contorno interior es la seccin ms pequea. En un corte ptico se ve la disposicin de las capas de la exina alrededor del poro. Puede ocurrir que las capas de la exina no se desdoblen, es decir, que no exista separacin entre las partes interna y externa de la exina; son los poros sin cmara o vestbulo. Por el contrario, en otros casos se produce la separacin entre dichas partes de la exina, originando una cavidad por debajo de la ectoapertura; en este caso se habla de poros con cmara o vestbulo. Las aperturas varan en su disposicin pudiendo disponerse: En los polos (aperturas polares) En el ecuador En toda la superficie

Los colpus o poros pueden afectar a la ectexina (ectoaperturas) o bien a la endexina (endoaperturas). Si afectan a una sola capa, se habla de aperturas simples; de aperturas compuestas, cuando afectan a ambas capas (ectexina y endexina), siendo, en este caso, las aperturas diferentes en forma y tamao. A veces, afectando a ambas capas, no se presentan tales diferencias, por lo que en este caso se consideran como aperturas simples. Polen tpico de Vicia sp. (fig. 6) Mnada, isopolar, radiosimtrico; Prolado; Amb circular; Estructura tectada; Escultura rugulada en latitudes inferiores y llegando a ser psilada hacia los polos; Tricolporado, colpi moderadamente largos, ensanchados ecuatorialmente donde est el poro, estrechndose, en gran medida meridionalmente, costae evidente, poros circulares. Medidas en : P: 38.5 2.5 y E: 24.2 0.7 (Heusser, 1971).

Fig. 6. Polen de haba, 49 y 59 polen de raphanus sativus (rabanito). VIABILIDAD DEL POLEN La viabilidad del polen hace referencia a los mtodos de tincin utilizados para conocer la calidad del pone previo a la polinizacin. Los granos de polen redondeados y coloreados de rojo se consideran viables y no viables los costreidos y sin teir. Existe una clasificacin visual de los granos de polen basada en la forma y contenido, utilizndose para las tinciones Acetocarmin y lactofenol. Por ejemplo: Los conteos de polen se efectuaron en nmero de 200 granos por preparacin en un total de 5 preparaciones. Se utiliz polen fresco (primer da de colectado) y almacenado por 150 das a 17C y 4C y se estimaron los porcentajes de viabilidad del polen fresco y almacenado, y se realizaron mediciones del dimetro del polen (um) de algunas especies silvestres y cultivadas de papa. La VIABILIDAD del grano de polen, previo a la polinizacin puede evaluarse mediante TEST BIOLGICOS basados en la germinacin en medios nutritivos Azucarados o mediante reacciones qumicas de coloracin. Uno de ellos consiste en recolectar polen a partir de la DEHISCENCIA, sembrado ste es un medio de cultivo estril y colocado en condiciones controladas, es posible determinar la evolucin diaria del proceso de maduracin de la gameta, previamente a la fecundacin. Otra tcnica consiste en colorear granos de polen con CROMATO POTSICO FRRICO al 1% en solucin acuosa filtrada y estabilizada durante 24 horas a temperatura de laboratorio. La observacin microscpica de una cantidad conocida de granos permite determinar los porcentajes de polen viable (coloreado de ROJO) y no viable (no coloreados, BLANCOS). La germinacin del polen IN VITRO son mtodos efectivos para la estimacin de la CALIDAD del polen, los cuales estn relacionados con el nmero de semillas por fruto, permitiendo estimados confiables de fertilidad masculina y de esta forma seleccionar al que ser utilizado

como progenitor masculino o femenino. Sin embargo, la germinacin in vitro es un mtodo mas fcil y aporta resultados confiables. Adems el polen no debe conservarse a 4C y 17C por ms de 10 y 5 das para ser utilizado en las polinizaciones. En haba (Vicia faba) la germinacin del polen y el alargamiento del tubo son procesos biolgicos, y como tal son inhibidas por temperaturas muy bajas o muy altas, pero en V. faba su polen es capaz de germinar entre 10 y 30 C y la evaluacin de viabilidad se puede hacer dentro de este rango. Sin embrago, la temperatura ptima para el crecimiento del tubo polnico, cae dentro de un rango estrecho. Las temperaturas ptimas entre 20 a 25 C, fuera de este rango de crecimiento del tubo ser ms lento. Ningn factor opera de forma independiente, observndose que el polen de V. faba se desarrolla mejor en un medio compuesto por un 2% de agar y sacarosa al 25% en peso se incuba a 25 C. una duracin de dos horas de incubacin era necesario para el crecimiento mximo in vitro. (Lim, 1979) Tabla 6. Efecto de la concentracin de agar y sacarosa y la duracin de la incubacin en la germinacin del polen de Vicia faba.

MATERIALES Material vegetal: botones florales de haba; Aceto carmn al 4%, Lacto propionico orceina o Aceto orceina; porta y cubre objetos; placas Petri y microscopio electrnico. METODOS Tincin de los granos de polen a. Colectar flores abiertas o maduras (con anteras dehiscentes) en placas Petri. b. Colocar grano de polen en un porta objeto, agregar una gota de acetocarmn y poner un cubre objeto, luego dejar a T ambiente. c. Realizar la evaluacin contando el nmero de polen teido y no teido en unos 5 campos pticos por cada flor, en un microscopio de aumento de 100X a 400X. d. Se considera que los granos bien formados y teidos son frtiles o por lo menos son viables, y los granos deformes y no teidos son esteriles, se expresa en porcentaje segn la formula:

% Viabilidad = N de granos bien formados y teidos * 100 N total de granos RESULTADOS Lectura del polen de Vicia faba, contaje de polen Total = 74 Viable =73 No Viable = 1 Viabilidad = 98,64 % CONCLUSIONES Los resultados indican una buena calidad del polen por lo que lo habilita para realizar el proceso de hibridacin por polinizacin manual. De la tabla 6 se puede observar una germinacin de 94,6% con una concentracin de agar 3%, similares a nuestras condiciones en laboratorio, pues se utiliz una concentracin de agar 4%, pudindose evaluar a germinacin tambin para ratificar el la calidad del polen.

BIBLIOGRAFIA Ulriksen Ruiz, Priscilla. (Agosto 2003). Anlisis Vegetacional y Palinolgico de Especies Dominantes de la Comuna de Litueche, VI Regin. Tesis para obtener Ttulo de Ingeniero Agrnomo, Facultad de Agronoma e Ingeniera Forestal, Pontificia Universidad Catlica de Chile, Santiago de chile, Chile. 83 p. web: [http://www.culturaapicola.com.ar/apuntes/floraapicola/139_analisis_vegetacion.pdf] Mara Elena Gonzlez, et. al. (2002). La Calidad del Polen: Requisito Indispensable del Mejoramiento Tradicional de la Papa en Cuba. En: Revista latinoamericana de la Papa, Vol. 13, num. 1, pp 75-94. Web: [http://www.papaslatinas.org/v13n1p75.pdf] Lim, E. S.(1979). Pollen Studies on Vida laba L. I, Germination Medium and Incubation Duration and Temperature [Estudios de polen en Vicia faba L. germinacin y duracin media de incubacin y la temperature]. En: Pertanika, 2 (2). pp. 74-77. Faculty of Agriculture, Universiti Pertanian Malaysia. Web: [http://psasir.upm.edu.my/2012/]