KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa,karena atas berkat dan rahmatNyalah penulis dapat menyelesaikan makalah yang berjudul KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Adapun makalah ini dibuat untuk memenuhi persyaratan tugas pada mata kuliah Kimia Analitik II. Pembuatan makalah ini diharapkan dapat membantu para pembaca atau mempermudah para pembaca dalam mempelajari Kimia Analitik II terutama dalam Subbab kromatografi lapis tipis. Pembuatan makalah juga diharapkan juga semakin menambah wawasan bagi semua , agar tujuan pembuatan dan target yang diharapkan tercapai . Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada dosen yang mengajarkan mata kuliah ini,atas segala petunjuk dalam pembuatan makalah ini. Seperti pepatah yang mengatakan tidak ada gading yang tak retak,begitu juga dengan makalah ini masih jauh dari sempurna.Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran dari pembaca demi kesempurnaan makalah ini.Terima Kasih

Medan,02 Mei 2013

Penulis

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .................................................................................................................... 1 DAFTAR ISI................................................................................................................................... 2 BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................................... 3 1.1 LATAR BELAKANG........................................................................................................... 3 1.2 TUJUAN ............................................................................................................................... 3 BAB II ISI ....................................................................................................................................... 4 2.1 TINJAUAN TEORITIS ........................................................................................................ 4 2.2 PERCOBAAN ...................................................................................................................... 9 BAB III PENUTUP ...................................................................................................................... 14 3.1 KESIMPULAN .................................................................................................................. 14 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................... 15

BAB I PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Penggunaan kromatografi lapis tipis dalam kehidupan sehari hari dapat dimanfaatkan dalam berbagai hal. Selain karena aplikasinya yang beragam, kromatografi lapis tipis juga memiliki keuntungan yang sangat sederhana. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak.
Karena dilatarbelakangi hal tersebutlah penulis menyusun makalah ini. Selain untuk menambah wawasan penulis dan pembaca mengenai kromatografi lapis tipis, penyusunan makalah ini juga untuk memenuhi tugas dan kewajiban penulis sebagai mahasiswa di Universitas Negeri Medan.

1.2 TUJUAN
Untuk menambah wawasan pembaca mengenai kromatografi lapis tipis Untuk memenuhi tugas dan tanggung jawab mata kuliah Kimia Analitik II penulis sebagai mahasiswa

BAB II ISI
2.1 TINJAUAN TEORITIS
Kromatografi adalah suatu metoda pemisahan campuran senyawa atau komponen tersebut antara dua fasa yaitu a. Fasa diam ( absorben atau lapisan penyerap ) Betindak sebagai pemisah campuran tersebut. Contoh pelarut yang digunakan adalah slika gel, aluminium oksida, selulosa. Namun yang paling banyak digunakan adalah slika gel dan alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh terhadap daya. b. Fasa gerak ( Eluen ) Bertindak sebagai pembawa campuran tersebut . komponenkomponen campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi pemisahaan. Prinsip KLT adalah untuk menentukan atau memisahkan campuran senyawa menjadi komponenkomponennya secara tepat. Mudah dan cepat berdasarkan perbedaan dari daya serap masingmasing komponen berdasarkan perbedaan distribusi. Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak. Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan

kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata maka lempeng dikeringkan. Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kira-kira setengah jam. Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium. Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikrosyiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 10 g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolomkolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam kromat seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan pengerokan setelah pemisahan selesai. Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya : 1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan. 2. Tidak memerlukan waktu yang banyak 3. Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT 4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut.

Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan menggunakan kromatografi lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat. Pada KLT terdapat adsorben yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide), kieselguhr (iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang sering dipakai adalah silika gel. Selain terdapat fasa stationer atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, kloroform (kloroform yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum. Kromotografi lapisan tipis dikembangkan oleh Egon Stahl dengan menempelkan adsorben pada lempengan gelas, sehingga merupakan lapisan. Komponen yang lebih kuat diserap oleh adsorben akan lebih lambat naiknya dari komponen yang kurang diserap, adsorben akan lebih cepat naiknya ke plat, sehingga pada plat akan terdapat komponen-komponen yang tersusun sepanjang plat. Kondisi optimum suatu pemisah merupakan hasil kesesuaian antara absorben dan eluen. Untuk mengidentifikasi komponen yang satu dengan yang lainnya digunakan faktor refensi (Rf). Jarak yang ditempuh komponen dapat diperbesar menggunakan pelarut polar, sebaliknya ukuran identitas bercak dapat untuk mempekirakan kadar dari masing-masing komponen yang terdapat dalam campuran. Untuk zat yang bersifat asam / basa kuat yang tidak dapat dilakukan dengan kromotografi kertas dapat dipisahkan dengan KLT. Pemisahan pada KLT didasarkan pada: - Penyerapan, pembagian, pertukaran ion, dan gabungan dari ketiganya. Faktor-faktor yang mempengaruhi Rf adalah: Adanya ion, Kesamaan larutan lainnya, Adanya kation dlam kosentrasinya. Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf: Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas, Struktur kimia dari senyawa dipisahkan, Kerapan dari satu pasang penyerap, Pelarut

II. IDENTIFIKASI DAN HARGA Rf Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada KLT lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna. Sebagian besar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep lempeng teori lebih sukar digambarkan disini, tetapi jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan berturutan cuplika dalam dua fase, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Tetapi lazimnya untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam KLT kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Derajat retensi pada klomatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi Rf: Jarak yang ditempuh senyawa terlarut Rf = Jarak yang ditempuh pelarut

Definisi koefisien distribusi K adalah K = CS CM CS : kadar senyawa terlarut dalam fase diam CM : kadar senyawa terlarut dalam fase gerak

Ada hubungan sederhana antara harga K dan Rf. Jarak tempuh rata-rata molekul terlarut berbanding langsung dengan kecepatan air pelarut dikalikan dengan fraksi waktu senyawa terlarut terdapat dalam fase gerak. Kemudian dapat dinyatakan sebagai jumlah molekul dalam setiap fase atau sebagai disrtibusi senyawa terlarut dalam dua fase:

jumlah mol senyawa terlarut dalam fase gerak Rf =Mol total senyawa terlarut dalam dua fase = CM AM+ CSAS

Dimana AM dan AS adalah luas penampang melintang dua fase itu ( tegak lurus lempeng). Penjabaran lebih lanjut persamaan diatas, diperoleh:

Rf = AM = ASCS/CM AM + KAS Hargaharga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh. Pengukuran yang sering dipakai lainnya adalah menggunakan pengertian RX atau RSTD yang didefinisikan sebagai berikut: RSTD = Jarak yang digerakkan oleh senyawa tak diketahui

KEGUNAAN KLT UNTUK ANALISA OBAT 1. Adiploidon (Iodipamid) (dalam Bulk) Fase diam : Silika HF254 Fase gerak : n-butanol-asam asetat-air (4 : 1 :5) Deteksi : UV 253 nm Penyiapan sempel : Sebanyak 1 mg dilarutkan kedalam metanol 0,08%-NaOH

2. Alanin (dalam bulk) Fase diam : Silika Fase gerak : n-butanol-air-asam asetat (3 : 1 :1) Deteksi : Ninhidrin Penyiapan sampel : Dilarutkan kedalam etanol 60%

3. Albenazol (dalam bulk) Fase diam : Silika Fase gerak : Metil klorid-asam asetat-eter (6 :1 : 1) Deteksi :UV panjang gelombang pendek Penyiapan sampel : Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan kedalam 3,0 ml asam asetat lalu diencerkan sampai 50,0 ml dengan asam asetat. Sebanyak 1,0 ml larutan ini diencerkan sampai

100 ml dengan asam asetat.

4. Alfadolon Asetat (dalam bulk) Fase diam : Silika Fase gerak : Toluen-etil asetat (1 : 1) Deteksi : Seri sulfat Penyiapan sampel : Dilautkan ke dalam metanol-kloroform (1 : 1) 5. Alkometason Dipropianat (dalam bulk) Fase diam : Silika Fase gerak : Kloroform-aseton (7 : 1) Deteksi : UV 350 nm Penyiapan sampel : Dilarutkan ke dalam metanol-diklorometan (1 :2)(dalam krim) Fase diam : Silika Fase gerak : Kloroform-aseton (7 : 1) Deteksi : UV 350 nm Penyiapan sampel : Ditambah metanol, dipanaskan pada suhu 60oC sampai sempel melele bagian yang tidak larut dipindahkan, dan digojok kuat

2.2 PERCOBAAN : PEMANFAATAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DALAM MEMISAHKAN ASAM AMINO
ALAT DAN BAHAN 1. Alat : a) pelat kromatografi b) selembar kaca c) penggiling 2. Bahan a) silika gel b) pelarut etanol c) larutan ninhidrin

d) beker gelas e) pengaduk magnetik f) gelas ukur

d) larutan Kuprinitrat e) larutan asam amino (arginin, asam glutamate,histidin dan alanin) f) aquadest

g) pipet tetes h) penyemprot i) j) penggaris pensil

PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kirakira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.

Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring

10

yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.

Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.

Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. (b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

HASIL PENGAMATAN

Sampel Arginin Asam Glutamat Histidin Alanin Sampel

Jarak 7,8 cm 8,5 cm 3 cm -

Warna Biru Merah Ungu -

11

PEMBAHASAN

Pada percobaan mengenai kromatografi lapis tipis ini dilakukan untuk mengetahui harga Rf dari beberapa macam asam amino yang diujikan. Asam amino yang diuji dalam percobaan ini ialah arginin, asam glutamate, histidin dan alanin . keempat asam amino ini mewakili masingmasing dari golongan asam amino Pada percobaan ini kaca yang digunakan harus benar-benar bersih bebas dari lemak oleh karena itu dibersihkan menggunakan deterjen, dan dikeringkan di udara. Fase gerak dan fase diamnya adalah etanol dan silica gel. Pada awalnya dilakukan pembuatan lapisan dari silica gel. pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 25 gr silika gel dengan 50 ml air yang dituangkan kedalam plat kaca. Kami melakukan pengulangan beberapa kali karena lapisan silica gel kami pada awalnya terlalu tebal sehingga mudah hancur dan juga permukaannya bergelombang. Oleh karena itu untuk membuat lapis tipisnya frame pada pinggiran kacanya harus dibuat rata serta pada saat penarikan seilikanya harus dalam satu kali tarikkan agar permukaannya tidak bergelombang. Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam amino yang kami lakukan dengan jarak 1,5 cm dari tepi bawah. Eluen yang akan dijalankan diukur sepanjang 10 cm. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap dijalankan ( dengan etanol). Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan. Untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino dapat disemprotkan dengan larutan ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna merah pada asam amino. Kemudian, plat kacanya harus dikeringkan. Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu adanya penyemprotan larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak bercak atau

12

noda. Noda yang dihasilkan untuk argini berwarna biru, asam glutamat merah sedangkan alanin berwarna unguuntuk histidin dan larutan sampel tidak menimbulkan bercak warna sehinggga dapat disimpulkan bahwa larutan sampel adalah histidin. Dari analisa data yang diperoleh, Rf untuk teori dan praktek agak berbeda. Hal ini dapat saja disebabkan oleh :kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya, kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang terlalu dekat. Dari hasil Rf yang diperoleh tidak sama dengan data Rf pada handbook. Hal ini dapat disebabkan oleh kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya, membuat sampel larutan, suhu saat kromatografi serta penetesan sampel yang tidak merata serta jaraknya terlalu dekat .

13

BAB III PENUTUP

3.1 KESIMPULAN
1. Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yang digunakan harus benar-benar terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi. 2. Kromatografi merupakan salah satu cara untuk melakukan pengidentifikasikan suatu asam amino salah satunya kromatografi lapis tipis. 3. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen (fase gerak)nya adalah etanol. 4. Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membandingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat. 5. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya karena terjadi ikatan kompleks Cu- ninhidrin yang berwarna

14

DAFTAR PUSTAKA

Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press Lehninger, 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ERLANGGA Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Suharta. 2012. Kimia Analitik II. Medan : FMIPA UNIMED kriemhild.uft.uni-bremen.de/nop_www/id/articles/pdf/Chromatography_id.pdf

15