Apostila Parasitologia Clnica

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SUMRIO

Introduo ................................................................................... 2 Mtodo da gota espessa.............................................................. 3 Exame direto a fresco ................................................................. 4 Tcnica de Hoffmann .................................................................. 4 Tcnica de Faust ......................................................................... 5 Tcnica da hematoxilina frrica .................................................. 6 Tcnica de Willis ..........................................................................8 Tcnica de Kato ........................................................................... 9 Exame parasitolgico de fezes (rotina do LAC-USP) .................. 10 Tcnica de Stoll .......................................................................... 12 Tcnica de Ritchie ..................................................................... 13 Tcnica de Rugai ........................................................................ 14 Tcnica de colorao de Kynion ................................................ 15 Tcnica do Swab (VASPAR) ........................................................ 19 Bibliografia recomendada para estudo ...................................... 20

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INTRODUO

A Parasitologia Clnica na prtica, consiste no aprendizado de tcnicas mais utilizadas no diagnstico das principais parasitoses intestinais e sanguneas, preparando o aluno para atuar em sade pblica, educao e pesquisa. Sejam bem vindos !

Professoras: LUCIA MARIA BRAGAZZA e SORAYA EL KHATIB

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MTODO DA GOTA ESPESSA

1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. 2. Colocar em Lmina de microscopia trs a quatro gotas de sangue fresco, colhidas por puno venosa ou da polpa digital. 3. Com a ponta de outra lmina e com movimentos circulares, contnuos, reunir as gotas, criando uma rea de aproximadamente 2 cm de dimetro. Continuar com movimentos circulares, do centro para a periferia, durante 30 segundos para evitar a formao de fibrina, a qual poder obscurecer as preparaes coradas. 4. Terminar os movimentos circulares no centro do crculo de sangue; por meio desse procedimento o esfregao apresenta a borda fina e o centro espesso. 5. Deixar secar temperatura ambiente e, aps, mergulhar a preparao em gua corrente ou em soluo salina a 0,85%, para que se produza a hemlise. Secar temperatura ambiente.

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EXAME DIRETO A FRESCO DE SUSPENSO DE FEZES

1. Suspender por meio de um palito, pequena poro de fezes em gota salina previamente colocada sobre uma lmina. 2. Examinar ao microscpio

TCNICA DE HOFFMANN

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartvel. Acrescentar aproximadamente 20 ml de gua morna aos poucos. Homogeneizar as fezes totalmente com o auxlio de um palito. Transferir para um clice afunilado coando em filtro para fezes. Acrescentar gua da torneira at encher o clice. Deixar em repouso at a sedimentao (2 a 24 horas). Com o auxlio de uma pipeta Pasteur recolher o sedimento, gotejar sobre uma lmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamnula e cobrir com a prpria lamnula. 8. Examinar ao microscpio.

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TCNICA DE FAUST

Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartvel. Acrescentar aproximadamente 20 ml de gua morna aos poucos. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxlio de uma esptula. Coar a suspenso de fezes em filtro prprio para fezes ou gaze. Recolher o filtrado em tubo de centrfuga e centrifugar a 2500 rpm durante 01 minuto. 6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua 7. Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto e desprezar o sobrenadante, 8. Se necessrio repetir a lavagem at que o sobrenadante fique claro. 9. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180) completando o volume do tubo at 1 cm da boca do mesmo. 10.Centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto. 11.Retirar a pelcula da superfcie delicadamente com o auxlio de uma ala dobrada em anel. 12.Colocar as gotas obtidas com a ala de anel para uma lmina com lugol 13.Cobrir com uma lamnula 14.Examinar ao microscpio

1. 2. 3. 4. 5.

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TCNICA DE HEMATOXILINA FRRICA ( segundo Cludio Santos Ferreira)

1. Fazer o esfregao bem fino em lmina misturando fezes com uma pequena gota de soro (usar de preferncia muco e fezes lquidas para a pesquisa de trofozotos). 2. Fixador de Bouin - 1 a 2 minutos. 3. Lavar em lcool. 4. Lavar em gua corrente - 2 minutos. 5. Mordente (almen frrico a 2%) - 5 minutos. 6. Hematoxilina - 5 minutos. Controlar a colorao, observando o esfregao at atingir a cor azul cinzenta. 7. gua corrente - 1 minuto. 8. Diferenciador (almen frrico a 2%) se necessrio. 9. gua corrente. 10. Montar em Blsamo do Canad.

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Sol. de Almen Frrico.

Mordente Almen de ferro puro.....................................................2.0 g. (Sulfato de amnio e ferro III) gua destilada..............................................................100 ml. Diferenciador Almen de ferro puro.....................................................0.5 g. gua destilada...............................................................100 ml. Triturar em almofariz e dissolver a frio. A sol. se conserva por perodos curtos, por isso deve-se preparar pequenas quantidades de cada vez. Guardar em frasco mbar.

Soluo de Hematoxilina Cristais puros de hematoxilina...............................................0.5 g. lcool a 95%...........................................................................10 ml. gua destilada q.s.p. .............................................................100ml. Deixar em recipiente de boca larga, tampado com gaze durante alguns dias ( no mnimo 2 dias). Completar at o volume original. Acrescentar 0.02 g. de c. ctrico puro.

TCNICA DE WILLIS
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Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartvel. Acrescentar aproximadamente 20 ml de gua morna aos poucos. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxlio de um palito. Transferir para um clice afunilado coando em filtro prprio para fezes. Transferir para um tubo de centrfuga e centrifugar a 2500 rpm por 02 minutos. Desprezar o sobrenadante Ressuspender o sedimento em sol. saturada de NaCl, completando o volume do tubo com esta soluo at formar um menisco. Colocar uma lmina sobre a boca do tubo. Deixar em repouso durante 15 a 45 minutos (no ultrapassar os 45 minutos, pois os ovos comeam a descer). Retirar a lmina virando bruscamente. Examinar ao microscpio.

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TCNICA DE KATO (modificado por KATZ e cols.)

Preparar uma sol. de verde de malaquita (esse produto tem a finalidade de conservar e clarificar as fezes a serem examinadas ) usando as seguinte frmula: glicerina............................................100 ml gua dest. ........................................100 ml verde de malaquita a 3%..................1 ml

Cortar papel celofane semi-permevel (molhvel) em pedaos de 24 mm por 30 mm e deix-los mergulhados na sol. de verde de malaquita por 24 horas. Colocar sobre um pedao de papel higinico uma poro de fezes a ser examinada. Comprimir a parte superior com um pedao de tela metlica. Nessa malha s passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferlas com o auxlio de uma esptula, para um carto retangular, contendo no seu centro um orifcio de 6 mm de dimetro ( as fezes so colocadas nesse orifcio). Aps encher completamente o orifcio, retirar o carto cuidadosamente deixando as fezes sobre a lmina de vidro. Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane, comprimindo-a aps t-la invertido contra uma folha de papel absorvente. Aguardar 1 a 2 horas e examinar ao microscpio (todos os campos) O nmero de ovos encontrados no esfregao fecal, multiplicado por 23 corresponder ao nmero de ovos por grama de fezes.

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EXAME PARASITOLGICO DE FEZES (ROTINA do LAC -USP) Tcnicas de Hoffmann, Ritchie, Faust

1. 2. 3. 4. 5.

Enumerar o material Colocar aproximadamente 5 g de fezes no copo descartvel Acrescentar aproximadamente 50 ml de gua morna aos poucos Homogeneizar totalmente as fezes com o auxlio de uma esptula Transferir para um clice afunilado coando em filtro prprio para fezes 6. Acrescentar gua de torneira at 2/3 do clice 7. Transferir para 2 tubos de centrfuga quantidade suficiente do filtrado para atingir aproximadamente 1 cm abaixo da borda do tubo. Um dos tubos ser utilizado para execuo da tcnica de Faust (1) e o outro tubo ser utilizado para a execuo da tcnica de Ritchie (2) 8. Acrescentar gua de torneira no clice at atingir o volume inicial ( 2/3 do clice), a fim de executar a tcnica de Hoffmann 9. Deixar em repouso at a sedimentao - de 2 a 24 horas 10.Com o auxlio de uma pipeta tipo Pasteur, recolher o sedimento e gotejar sobre uma lmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamnula e cobrir com a mesma 11.Examinar ao microscpio

(1) 1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 1 minuto 2. Decantar o sobrenadante e agitar at que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 3. Lavar o sedimento com gua at que o sobrenadante fique claro. 4. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180) completando o volume at 1 cm da boca do tubo e centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto. 5. Retirar a pelcula da superfcie delicadamente com o auxlio de uma ala dobrada em anel. 6. Passar a gota do anel para uma lmina com lugol
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7. Cobrir com uma lamnula 8. Examinar ao microscpio ( 2) 1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 2. Decantar e agitar at que o sedimento se desprenda do fundo 3. Adicionar ao sedimento 5 ml de formol a 10% 4. Deixar em repouso por no mnimo 5 minutos 5. Adicionar 2 ml de ter 6. Tapar o tubo e agitar vigorosamente 7. Tarar os tubos e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 8. Decantar e agitar para desprender o sedimento do fundo do tubo 9. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente Preparar uma lmina do sedimento e examinar

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TCNICA DE STOLL

uma tcnica quantitativa , na qual as fezes so ressuspensas em NaOH 0,1N que tem a finalidade de desagregar e clarificar o material. A suspenso feita em um frasco tipo Erlenmeyer , cujo gargalo traz duas marcas, uma indicando 56 cm e a outra 60 cm .

TCNICA:

1. Encher o frasco at a marca 56 com NaOH 0,1N. 2. Colocar fezes at o nvel atingir a marca 60. 3. Introduzir no frasco cerca de 10 prolas de vidro, tampar com rolha de borracha e em seguida agitar vigorosamente, para se obter uma suspenso homognea. 4. Retirar 0,15 ml da suspenso e colocar em uma lmina. Cobrir com uma lamnula e examinar ao microscpio , sob o aumento de 100 vezes. 5. Contar o nmero de ovos em toda a preparaco. 6. O nmero de ovos contados multiplicado por 100, d o nmero de ovos por grama de fezes.

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TCNICA DE RITCHIE

7. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartvel. 8. Acrescentar aproximadamente 20 ml de gua morna aos poucos. 9. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxlio de um palito. 10.Transferir para um clice afunilado coando em filtro para fezes. 11.Transferir para um tubo de centrfuga e centrifugar a 2.500 rpm durante 2 min. 12.Decantar e agitar at que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 13. Acrescentar 5 ml de formol a 10%. 14. Acrescentar 2 ml de ter. 15.Tapar o tubo e agitar vigorosamente. 16.Centrifugar novamente a 2.500 rpm durante 2 min. 17.Decantar e agitar at que o sedimento se desprenda do fundo do tubo. 18. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente. 19. Preparar uma lmina do sedimento e examinar ao microscpio.

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TCNICA DE RUGAI

1. Remover a tampa do recipiente contendo as fezes e envolver em pedao de gaze dupla (dobrada em duas partes) repuxando as bordas para trs. 2. Embocar os recipientes no interior de um clice cnico, fixando-o por presso contra as paredes, em posio levemente inclinada. 3. Colocar gua morna pelas paredes do clice aproveitando a abertura restante da posio inclinada do recipiente metlico. O lquido deve alcanar toda a extenso da abertura do recipiente. Evitar a formao de bolhas de ar. 4. Deixar em repouso por 90 min. 5. Sem retirar o recipiente, introduzir uma pipeta at o fundo do clice. Retirar o sedimento e colocar em uma lmina ou vidro relgio. 6. Examinar ao microscpio.

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TCNICA DE COLORAO DE KYNION PARA PESQUISA DE CRYPTOSPORIDIUM PARVUM E ISOSPORA BELLI

1a fase

Material utilizado

-Soluo de formalina tamponada a 10%, pH 7.2 em PBS -Gaze ou coador de nylon -Copo descartvel e clice

Descrio

- Homogeneizar 1 g. de fezes em 4 ml. de soluo de formalina tamponada -Filtrar em gaze ou coador de nylon -Transferir o material filtrado para os clices e manter em geladeira por 24 horas, no mnimo

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2a fase

Material utilizado

-Centrfuga -Tubos de centrfuga -Tampas de borracha -ter sulfrico

Descrio - Colocar no tubo de centrfuga 4 ml do material contido nos clices e adicionar 2 ml de ter sulfrico -Agitar o tubo ( tampado) vagarosamente -Centrifugar por 8 minutos a 1500 rpm -Desprezar o sobrenadante e limpar os detritos superficiais com um bastonete -Fazer o esfregao com o sedimento

Colorao -Deixar secar o esfregao -Fixar com metanol por 5 minutos -Cobrir o esfregao com sol. de fucsina carblica de Kynioun por 30 minutos temperatura ambiente
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-Lavar com gua -Lavar com lcool cido por 2 minutos. Caso o esfregao tenha ficado muito espesso e a colorao vermelha no tenha sido removida, repetir o procedimento -Lavar com gua -Cobrir toda a lmina com azul de metileno ou verde de malaquita por 1 a 2 minutos, lavar com gua e deixar secar

Reagentes Formalina Formol....................................................................................10 ml PBS pH 7.2 q.s.p. ..................................................................100ml

Fucsina carblica de Kynioun Fucsina bsica.....................................................................4 g. Cristais de fenol ou c. fnico.............................................8 g. lcool 95%...........................................................................20 ml gua dest. q.s.p. .................................................................100 ml

lcool- cido cido sulfrico conc............................................................5 ml lcool 70% q.s.p. ...............................................................100 ml

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Verde de malaquita Verde de malaquita ............................................................3 g. gua dest. ..........................................................................100 ml

Azul de metileno Azul de metileno..................................................................1 g. gua dest. ..........................................................................100 ml

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MTODO DO SWAB DE VASELINA E PARAFINA (VASPAR) 1. Mergulhar o swab de algodo em mistura de quatro partes de vaselina e uma parte de parafina (4:1). 2. Colocar o swab de algodo revestido com uma camada de vaselinaparafina em tubo de ensaio fechado com uma bucha de algodo. Armazenar no refrigerador . 3. Esfregar sutilmente o swab na superfcie perianal e introduzir pequena poro no orifcio anal. 4. Repor o swab no tubo. 5. Encher 1/3 do tubo com xilol ou com quantidade suficiente para cobrir o swab. Deixar em repouso por 5 minutos. 6. Remover o swab e centrifugar (500 x g/1min) 7. Com a pipeta capilar, colher o sobrenadante. Transferir vrias gotas para uma lmina de microscopia. No necessrio cobrir a preparao com lamnula. Para evitar a expanso do material em uma grande rea, colocar as gotas no centro de um anel desenhado com lpis de cera e examinar imediatamente. O anel pode ser dissolvido com xilol. Observao: Este exame deve ser realizado pela manh, antes do paciente defecar ou banhar-se.

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BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA PARA ESTUDO

DE CARLI, G. A. Parasitologia Clnica. Seleo de mtodos e tcnicas de laboratrio para o diagnstico das parasitoses humanas. Ed. Atheneu, 2001. HENRY, J.B. Diagnsticos clnicos e tratamento por mtodos laboratoriais. So Paulo: Manole, 2007. MELO, A. L., LINARDI, P.M., VITOR, R.W.A. Parasitologia Humana. 11 Edio. Ed. Atheneu, 2005. Pranchas para o Diagnstico de Parasitas Intestinais. Organizao Mundial de Sade. Ed. Livraria Santos, 2005.

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