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Isolation and purification of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

L o g i n| U s e r s O n l i n e : 3 3 H o m e | A b o u t u s | E d i t o r i a l b o a r d | S e a r c h | A h e a d o f p r i n t | C u r r e n t I s s u e | P a s t I s s u e s | I n s t r u c t i o n s | O n l i n e s u b m i s s i o n

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S h a S r e h a S r e h a S r e h a S r e h a S r e h a Mo r er e
S i m i l a r i n P U B ME D Search Pubmed for G a r g N G u p t a H ORIGINAL ARTICLE Year : 2 0 1 0| Volume : 2| Issue : 1| Page : 3 8 4 3 I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n ( Macrophomina phaseolina) i n d u c e d c h i t i n a s e f r o mm o t h b e a n s ( Phaseolus aconitifolius)
1 2 N e e l i m a G a r g , H i m a n s h u G u p t a 1 B a n a s t h a l i U n i v e r s i t y , R a j a s t h a n 3 0 4 0 2 2 , I n d i a 2 J a m i a H a m d a r d , H a m d a r d U n i v e r s i t y , N e wD e l h i 1 1 0 0 6 2 , I n d i a

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D a t e o f S u b m i s s i o n D a t e o f D e c i s i o n D a t e o f A c c e p t a n c e D a t e o f We b P u b l i c a t i o n

1 2 J a n 2 0 1 0 2 8 J a n 2 0 1 0 2 5 F e b 2 0 1 0 2 3 A p r 2 0 1 0

Correspondence Address : H i m a n s h u G u p t a J a m i a H a m d a r d , H a m d a r d U n i v e r s i t y , N e wD e l h i 1 1 0 0 6 2 I n d i a DOI: 1 0 . 4 1 0 3 / 0 9 7 5 7 4 0 6 . 6 2 7 0 8 PMID: 2 1 8 1 4 4 2 9

In this a r t i c l e A b s t r a c t Ma t e r i a l s a n d Me . . . R e s u l t s a n d D i s c . . . C o n c l u s i o n R e f e r e n c e s A r t i c l e F i g u r e s A r t i c l e T a b l e s Article Access Statistics V i e w e d 2 6 4 9 P r i n t e d 1 4 6 E m a i l e d 4 P D FD o w n l o a d e d 2 5 1 C o m m e n t s [ A d d ]

A b s t r a c t

Objective : C h i t i n a s e ( E C3 . 2 . 1 . 1 4 ) i s o n e o f t h e m a j o r p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n s , w h i c h i s a p o l y p e p t i d e t h a t a c c u m u l a t e s e x t r a c e l l u l a r l y i n i n f e c t e d p l a n t t i s s u e . A n a t t e m p t w a s m a d e t o i s o l a t e a n d p u r i f y t h e c h i t a n a s e e n z y m e u s i n g m o t h b e a n s a s a n e n z y m e s o u r c e . Materials and Method : T h e e n z y m e w a s i s o l a t e d a n d p u r i f i e d f r o mm o t h b e a n s a g a i n s t t h e f u n g a l p a t h o g e n Total downloads in last 2 Macrophomina phaseolina s t r a i n 2 1 6 5 . T h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n w a s d o n e i n b o t h in vitro a n d in vivo c o n d i t i o n s . months P u r i f i c a t i o n o f c h i t i n a s e w a s c a r r i e d o u t t o o b t a i n t h r e e f r a c t i o n s , v i z . 5 0 Ch e a t e d , a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t e d a n d s e p h a d e x Mar 22 2013 G 2 5 c o l u m n e l u t e d f r a c t i o n s . T h e m o l e c u l a r m a s s o f C h i t i n a s e w a s d i r e c t l y e s t i m a t e d b y s o d i u md o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y a m i d e Feb g e l e l e c t r o r e s i s ( S D S P A G E ) . Result : T h e y i e l d i s s u f f i c i e n t f o r i n i t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n s t u d i e s o f t h e e n z y m e . T h e m o l e c u l a r s t u d y 2013 81 o f t h e e n z y m e s h o w s t h e p o s s i b i l i t y o f g e n e r a t i n g t h e d e f e n s e m e c h a n i s mi n p l a n t s i n w h i c h i t c a n n o t o c c u r . C h i t i n a s e w a s p u r i f i e d b y g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y w i t h 2 0 . 7 5 f o l d a n d 3 2 . 7 8 f o l d p u r i f i c a t i o n i n t h e in vitro a n d in vivo c o n d i t i o n s , r e s p e c t i v e l y . T h e e n z y m e s h o w s a m a x i m u ma c t i v i t y a f t e r 9 0 m i n w i t h 0 . 1 m l o f c o l l o i d a l c h i t i n a s a s u b s t r a t e a n d 0 . 4 m l o f c r u d e c h i t i n a s e e x t r a c t . T h e o p t i m u mp Ho f 5 . 0 a n d a n o p t i m u mt e m p e r a t u r e o f 4 0 Cw a s f o u n d f o r m a x i m a l a c t i v i t y . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f Ads by Google p u r i f i e d c h i t i n a s e w a s e s t i m a t e d t o b e 3 0 k D a b y S D S P A G E . Conclusion : T h e c h i t i n a s e i s o l a t e d i n b o t h in vitro a n d in vivo Journal Research c o n d i t i o n s i s s t a b l e a n d a c t i v e . Journal Science Keywords: C h i t i n a s e , Macrophomina phaseolina, Phaseolus aconitifolius, p u r i f i c a t i o n International Journal
jpbsonline.org/article.asp?issn=0975-7406;year=2010;volume=2;issue=1;spage=38;epage=43;aulast=Garg

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Isolation and purification of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

How to cite this article: G a r g N , G u p t a H . I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n ( Macrophomina phaseolina) i n d u c e d c h i t i n a s e f r o mm o t h b e a n s ( Phaseolus aconitifolius) . J P h a r mB i o a l l S c i 2 0 1 0 ; 2 : 3 8 4 3 How to cite this URL: G a r g N , G u p t a H . I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n ( Macrophomina phaseolina) i n d u c e d c h i t i n a s e f r o mm o t h b e a n s ( Phaseolus aconitifolius) . J P h a r mB i o a l l S c i [ s e r i a l o n l i n e ] 2 0 1 0 [ c i t e d 2 0 1 3 Ma r 7 ] ; 2 : 3 8 4 3 . A v a i l a b l e f r o m : h t t p : / / w w w . j p b s o n l i n e . o r g / t e x t . a s p ? 2 0 1 0 / 2 / 1 / 3 8 / 6 2 7 0 8 C h i t i n a s e s a r e u b i q u i t o u s e n z y m e s o f b a c t e r i a , f u n g i , a n i m a l s a n d p l a n t s . C h i t i n a s e ( E C3 . 2 . 1 . 1 4 ) i s o n e o f t h e m a j o r p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n s , i s a p o l y p e p t i d e t h a t a c c u m u l a t e s e x t r a c e l l u l a r l y i n i n f e c t e d p l a n t t i s s u e a n d e x h i b i t s h i g h r e s i s t a n c e [ 1 ] [ 2 ] , [ 3 ] t o p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n . C h i t i n a s e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e d e f e n s e r e a c t i o n s o f p l a n t s a g a i n s t p o t e n t i a l p a t h o g e n s . I n m a n y p l a n t s c h i t i n a s e s r a p i d l y a c c u m u l a t e f o l l o w i n g p a t h o g e n a t t a c k , a f t e r e l i c i t o r t r e a t m e n t a n d i n r e s p o n s e t o t h e p l a n t s t r e s s h o r m o n e e t h y l e n e . C h i t i n a s e c a t a l y z e s t h e h y d r o l y s i s o f c h i t i n , a l i n e a r h o m o p o l y m e r o f b 1 , 4 l i n k e d Na c e t y l d g l u c o s a m i n e ( N A G ) r e s i d u e s . C h i t i n i s n o t f o u n d i n p l a n t c e l l s , a l t h o u g h i t i s a c o m p o n e n t o f m a n y f u n g a l c e l l w a l l s a n d a r t h r o p o d e x o s k e l e t o n s . I s o l a t i o n o f g e n e s o f c h i t i n a s e s f r o mTrichoderma s p p . h a s b e e n r e p o r t e d a n d t h e s e g e n e s h a v e b e e n t r a n s f e r r e d t o p l a n t s i n [ 4 ] o r d e r t o i n c r e a s e t h e r e s i s t a n c e a g a i n s t p h y t o p a t h o g e n s . Mi c r o b i a l c h i t i n a s e s a r e w i d e l y d i s t r i b u t e d a n d p r o d u c e d i n b a c t e r i a s u c h a s Serratia, Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Vibrio, Arthrobacter, Beneckea, Aeromonas a n d Streptomyces. T h e y a r e a l s o f o u n d i n t h e f u n g i Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor, Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium, Stachybotrys a n d Agaricus.[ 5 ] Mi c r o o r g a n i s m s p r o d u c e c h i t i n a s e s i n h i g h e r a m o u n t s t h a n t h a t p r o d u c e d b y a n i m a l s a n d p l a n t s , g e n e r a l l y a s i n d u c i b l e e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s t h a t a r e o f t w o t y p e s : e n d o c h i t i n a s e s a n d e x o c h i t i n a s e s . C h i t i n a s e h a s b e e n p r o d u c e d a n d p u r i f i e d f r o mTrichothecium roseum, Streptomyces thermoviolaceus, Arabidopsis thaliana, Bacilluss p . B G 1 1 , p l a n k t o n i c b a c t e r i a , Stenotrophomonas maltophiliaC 3 .[ 6 ] , [ 7 ] , [ 8 ] , [ 9 ] , [ 1 0 ] , [ 1 1 ] T h e o p p o r t u n i s t i c f u n g a l p a t h o g e n Aspergillus fumigatus c o n t a i n s a t l e a s t 1 1 c o n s e r v e d a c t i v e s i t e d o m a i n s f o r c h i t i n a s e s o f g l y c o s y l h y d r o l a s e f a m i l y . T h e s e e n z y m e s m a y b e d i v i d e d i n t o ' f u n g a l / b a c t e r i a ' c h i t i n a s e s , s i m i l a r t o c h i t i n a s e s f r o mp l a n t s . ' F u n g a l / p l a n t ' c h i t i n a s e s o f Aspergilluss p . a n d Coccidioides immitis d i s p l a y e d m o l e c u l a r m a s s f r o m8 3 t o 9 7 k D a , w h e r e a s f u n g a l / b a c t e r i a l c h i t i n a s e s h a v e b e e n f o u n d t o h a v e m o l e c u l a r m a s s e s o f a p p r o x i m a t e l y 4 6 4 8 k D a . Mo t h b e a n ( Phaseolus aconitifolius) i s a n i m p o r t a n t k h a r i f p u l s e a s w e l l a s a f o d d e r c r o p i n a r i d a n d s e m i a r i d r e g i o n s , p a r t i c u l a r l y i n n o r t h w e s t e r n s t a t e s . I t b e l o n g s t o t h e f a m i l y l e g u m i n a c e a e a n d s u b f a m i l y p a p i l l i o n a c e a e . Mo t h b e a n i s d r o u g h t r e s i s t a n t , h a r d a n d i s a b l e t o s u r v i v e u n d e r d r y c o n d i t i o n s . I t c a n b e u s e d a s g r e e n m a n u r e , v e g e t a b l e a n d s n a c k . T h e p l a n t c o n s e r v e s m o i s t u r e , p r o t e c t s s o i l e r o s i o n a n d f i x e s a t m o s p h e r i c n i t r o g e n t h r o u g h s y m b i o s i s w i t h n o d u l e b a c t e r i a . T h e m a i n c o n t r i b u t i o n o f m o t h b e a n a s a f o o d i s b a s e d o n i t s p r o t e i n c o n t e n t , w h i c h r a n g e s f r o m2 0 t o 3 0 %. T h i s p l a n t i s i n f e c t e d b y f u n g i l i k e Fusarium s p . , Macrophomina phaseolina, Pythium s p . e t c . M. phaseolina i s a c o m m o n r o o t p a r a s i t e f o u n d i n w a r m e r l a n d s . I t i s o m n i v o r o u s a n d i s a w i d e l y i n f e c t i n g p a t h o g e n . My c e l i u m s p r e a d s t h r o u g h s o i l c a u s i n g s e e d l i n g b l i g h t ; s t e ma n d r o o t r o t o f h e r b a c e o u s p l a n t a n d a l s o d e c a y o f w o o d y p l a n t . A l t h o u g h e n o r m o u s w o r k h a s b e e n d o n e o n t h e d e f e n s e r e s p o n s e o f p l a n t s , t h e p r e s e n t s t u d y i s c o n f i n e d t o e x t r a c t i o n / i s o l a t i o n o f c h i t i n a s e f r o mR MO4 0 v a r i e t y o f m o t h b e a n s ( R MO4 0 i s t h e g e n o t y p e o f m o t h b e a n s ) t h r o u g h in vitro a n d in vivo p r o c e d u r e s b y i n d u c t i o n o f f u n g a l p a t h o g e n M. phaseolina a n d e v a l u a t i o n o f d i f f e r e n t p a r a m e t e r s l i k e t i m e , e n z y m e c o n c e n t r a t i o n a n d s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . T h e r e h a s b e e n r e p o r t o n t h e i s o l a t i o n o f c h i t i n a s e b y i n d u c t i o n o f M. phaseolina i n R MO4 0 v a r i e t y o f m o t h b e a n s . H e n c e , t h e o b j e c t i v e o f t h e p r e s e n t s t u d y i s t o i s o l a t e a n d p u r i f y c h i t i n a s e f r o mP. aconitifolius i n b o t h in vitro ( d e t a c h e d f r o m t h e s o i l ) a n d in vivo ( i n t a c t p l a n t i n s o i l ) c o n d i t i o n s , a g a i n s t t h e f u n g a l p a t h o g e n M. phaseolina s t r a i n 2 1 6 5 . T h e o p t i m u ma c t i v i t y o f c h i t i n a s e o n s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , u s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a s a s u b s t r a t e , i t s t i m e k i n e t i c s , m o l e c u l a r w e i g h t e t c . w e r e a l s o d e t e r m i n e d I n t h i s w o r k w e a l s o i l l u s t r a t e t h e e f f e c t o f f u n g a l i n f e c t i o n o n t h e p r o t e i n c o n t e n t o f m o t h b e a n p l a n t .

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Ma t e r i a l s a n d Me t h o d s

Materials P. aconitifolius w a s p r o c u r e d f r o mt h e A g r i c u l t u r e r e s e a r c h s t a t i o n D u r g a p u r a , J a i p u r . C u l t u r e s t r a i n o f M. phaseolina ( MT C C 2 1 6 5 ) w a s p r o c u r e d f r o mI MT E C HC h a n d i g a r h , I n d i a . S o d i u mc i t r a t e , s o d i u mp h o s p h a t e , p o t a s s i u mp h o s p h a t e , s o d i u mb o r a t e , a m m o n i u mh y d r o x i d e , d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e ( D MA B ) w e r e p r o c u r e d f r o mS i g m a , U S A . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o f a n a l y t i c a l g r a d e a n d w e r e p u r c h a s e d f r o ml o c a l v e n d o r s . Culture conditions P. aconitifolius w a s g r o w n a f t e r s u r f a c e s t e r i l i z a t i o n w i t h 0 . 1 %H g C l f o r 5 m i n i n p o t s i n a g r e e n h o u s e a t 2 8 2 Ca n d 6 0 % 2 r e l a t i v e h u m i d i t y ( R H ) . T h e c u l t u r e s t r a i n o f M. phaseolina ( MT C C2 1 6 5 ) w a s m a i n t a i n e d o n p o t a t o d e x t r o s e a g a r ( P D A ) s l a n t s oCa oCf a t 4 n d i n c u b a t e d a t 3 7 o r 1 0 d a y s f o r t h e p r o p e r g r o w t h a n d s p o r u l a t i o n . F o r c h i t i n a s e p r o d u c t i o n i n t h e p l a n t ,

jpbsonline.org/article.asp?issn=0975-7406;year=2010;volume=2;issue=1;spage=38;epage=43;aulast=Garg 2/6

3/7/13 o Isolation and purification o of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

a t 4 Ca n d i n c u b a t e d a t 3 7 Cf o r 1 0 d a y s f o r t h e p r o p e r g r o w t h a n d s p o r u l a t i o n . F o r c h i t i n a s e p r o d u c t i o n i n t h e p l a n t , i n o c u l u mw a s p r e p a r e d b y p r e p a r i n g t h e s p o r e s u s p e n s i o n u n d e r a s e p t i c c o n d i t i o n i n s t e r i l i z e d d i s t i l l e d w a t e r . P r o p e r d i s t r i b u t i o n oC o f s p o r e s w a s c a r r i e d o u t i n t h e i n c u b a t o r s h a k e r ( 2 8 2 ) a t 1 2 0 r p mf o r 2 h . T h e s p o r e s w e r e c o u n t e d w i t h h e m o c y t o m e t e r 5 ( F e i n o p t i c a J e n a , G e r m a n y ) a n d t h e c o n c e n t r a t i o n w a s m a i n t a i n e d a t 1 0 s p o r e s p e r m i l l i l i t e r . In vitro and in vivo studies

oC In vitro s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t i n l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s ( 2 8 2 , R H6 0 %) . L e a v e s o f 1 5 d a y o l d m o t h b e a n p l a n t w e r e s e p a r a t e d f r o mp o t s a n d t a k e n i n p e t r i p l a t e s ( 1 g e a c h t i m e ) . T h e n t h e s u r f a c e e p i t h e l i u mo f l e a v e s w a s i n j u r e d m i l d l y w i t h a n a b r a s i v e t o f a c i l i t a t e t h e e n t r y o f f u n g a l p a t h o g e n ( M. phaseolina) . F u n g a l s p o r e s u s p e n s i o n w a s i n o c u l a t e d o v e r t h e s u r f a c e i n j u r e d l e a v e s u s i n g t h e t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) s p r a y e r . E n z y m e e x t r a c t i o n o f b o t h c o n t r o l a n d i n o c u l a t e d l e a v e s w a s d o n e 0 , 4 , 2 4 , 4 8 , 7 2 a n d 1 6 8 h a f t e r i n o c u l a t i o n . A l l c o n d i t i o n s o f in vitro e x p e r i m e n t s w e r e k e p t t h e s a m e f o r in vivo oCa e x p e r i m e n t s e x c e p t t h e f a c t t h a t t h e in vivo e x p e r i m e n t s w e r e d o n e i n i n t a c t p l a n t s i n p o t i n t h e g r e e n h o u s e a t 2 8 2 t 6 0 % R H .

Assay of chitinase activity I n b o t h in vitro a n d in vivo c o n d i t i o n s , 1 g w e i g h e d p o r t i o n o f t h e c o n t r o l a n d i n o c u l a t e d l e a f t i s s u e s o f 1 5 d a y o l d p l a n t s o f R MO 4 0 v a r i e t y o f P. aconitifolius w a s t a k e n a f t e r 0 , 4 , 2 4 , 4 8 , 7 2 a n d 1 6 8 h . T h e t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n a p r e c h i l l e d m o r t a r p e s t l e i n 4 m l o f 0 . 1 Ms o d i u mc i t r a t e b u f f e r , p H5 . 0 . T h e h o m o g e n a t e w a s f i l t e r e d t h r o u g h p r e m o i s t e n e d ( i n 0 . 1 M s o d i u mc i t r a t e b u f f e r ) f o u r l a y e r e d c h e e s e c l o t h a n d t h e f i l t r a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r p mf o r 2 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d a n d t h e p e l l e t w a s r e d i s s o l v e d i n 2 m l s o d i u mc i t r a t e b u f f e r p H5 . 0 a n d r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r p mf o r 2 0 m i n . T h i s c o n s t i t u t e s t h e c r u d e e n z y m e e x t r a c t . Determination of chitinase activity C h i t i n a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d b y t h e r e l e a s e o f N A Gu s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a s a s u b s t r a t e a c c o r d i n g t o t h e p r e v i o u s r e p o r t e d [ 1 2 ] m e t h o d . B r i e f l y , t o 0 . 4 m l o f c r u d e e n z y m e s o l u t i o n , 1 0 m Ms o d i u mp h o s p h a t e b u f f e r p H5 . 0 w a s a d d e d . T h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 3 7 Ci n a s h a k i n g w a t e r b a t h b y a d d i n g 0 . 1 m l c o l l o i d a l c h i t i n a s a s u b s t r a t e . A f t e r 1 . 5 h , t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d a n d t h e r e a c t i o n m e d i u mw a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 r p mf o r 3 m i n . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n , 0 . 3 m l o f s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d t o a g l a s s t u b e c o n t a i n i n g 3 0 l o f 1 Mp o t a s s i u mp h o s p h a t e b u f f e r p H7 . 1 a n d i n c u b a t e d w i t h 8 9 . 5 l o f s n a i l g u t e n z y m e f o r 1 h t o c h a n g e t h e p Ht o 6 . 8 . T h e p Hw a s i n c r e a s e d t o 8 . 9 b y t h e a d d i t i o n o f 7 0 l o f 1 Ms o d i u mb o r a t e b u f f e r p H9 . 8 . Mi x t u r e w a s i n c u b a t e d i n a b o i l i n g w a t e r b a t h f o r e x a c t l y 3 m i n a n d t h e n r a p i d l y t r a n s f e r r e d t o i c e b a t h . A f t e r c o o l i n g , 2 m l o f D MA Br e a g e n t w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n a t 3 8 2 C . R e l e a s e o f N A Gf r o mt h e s u b s t r a t e w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e a b s o r b a n c e a t 5 8 5 n ma g a i n s t t h e e n z y m e a s b l a n k . O n e u n i t o f c h i t i n a s e i s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f e n z y m e t h a t r e l e a s e d 1 m o l o f N A Gp e r m i n u t e u n d e r t h e s p e c i f i c c o n d i t i o n s . T h e a m o u n t o f m o n o m e r r e l e a s e d w a s e x t r a p o l a t e d f r o mt h e s t a n d a r d g r a p h o f N A G . Purification of chitinases
oCh P u r i f i c a t i o n o f c h i t i n a s e s w a s c a r r i e d o u t t o o b t a i n t h r e e f r a c t i o n s , v i z . 5 0 e a t e d , a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t e d a n d s e p h a d e x G 2 5 c o l u m n e l u t e d f r a c t i o n s .

I n t h e f i r s t s t e p o f p u r i f i c a t i o n , t h e e n z y m e e x t r a c t w a s h e a t e d u p t o 5 0 Cw i t h v i g o r o u s s t i r r i n g f o r 2 0 m i n . A f t e r h e a t i n g , t h e e x t r a c t w a s c o o l e d f i r s t a t r o o mt e m p e r a t u r e , a n d t h e n c o o l e d b e l o w5 Ci n a n i c e b a t h . A f t e r c o o l i n g , i t w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r p mf o r 1 0 m i n a t 4 Ct o r e m o v e d e n a t u r e d p r o t e i n . I n t h e s e c o n d s t e p o f p u r i f i c a t i o n , t h e e n z y m e w a s p r e c i p i t a t e d u p t o 6 0 %b y a d d i n g a m m o n i u ms u l f a t e p o w d e r w i t h v i g o r o u s s t i r r i n g a t 0 Cf o r 1 h a n d t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r p mf o r 2 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e p e l l e t o b t a i n e d w a s d i s s o l v e d i n 1 0 m Ms o d i u ma c e t a t e b u f f e r p H5 . 0 . I n t h e t h i r d s t e p o f p u r i f i c a t i o n , t h i s p r o t e i n w a s l o a d e d o n a s e p h a d e x G 2 5 c o l u m n ( 1 . 0 4 0 . 0 c m ) p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h 1 0 m Ms o d i u m a c e t a t e b u f f e r p H5 . 0 . E l u t i o n w a s d o n e u s i n g t h e 0 . 0 5 Ma m m o n i u mh y d r o x i d e s o l u t i o n a n d t h e f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a t a f l o w r a t e o f 4 m l / h . F r a c t i o n s ( 1 . 0 m l ) w e r e c o l l e c t e d a n d a s s a y e d f o r c h i t i n o l y t i c a c t i v i t y u s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a s t h e s u b s t r a t e . F r a c t i o n s s h o w i n g m a x i m u mc h i t i n o l y t i c a c t i v i t y t o w a r d c o l l o i d a l c h i t i n w e r e c h e c k e d f o r p r o t e i n p u r i t y b y S D S P A G Eo n a [ 1 3 ] 1 2 . 0 %p o l y a c r y l a m i d e g e l b y t h e m e t h o d o f L a e m m l i . T h e g e l w a s s t a i n e d b y C o o m a s s i e b l u e . Effect of temperature on activity and stability of chitinase E f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n t h e a c t i v i t y o f c h i t i n a s e w a s s t u d i e d b y i n c u b a t i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m2 0 t o 6 0 Ca n d a s s a y i n g t h e e n z y m e b y t h e s t a n d a r d m e t h o d . T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n s t a b i l i t y o f c h i t i n a s e w a s d e t e r m i n e d b y e x p o s u r e o f t h e e n z y m e s o l u t i o n t o 1 0 m Ms o d i u mp h o s p h a t e b u f f e r p H5 a t a d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e . R e s i d u a l e n z y m e a c t i v i t y w a s t h e n m e a s u r e d u n d e r a s s a y c o n d i t i o n s u s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a s t h e s u b s t r a t e . Effect of time on chitinase activity I n f l u e n c e o f i n c u b a t i o n t i m e o n c h i t i n a s e a c t i v i t y w a s s t u d i e d b y v a r y i n g t h e i n c u b a t i o n t i m e f r o m6 0 t o 1 5 0 m i n . T h e r e s i d u a l a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e s t a n d a r d a s s a y m e t h o d .
jpbsonline.org/article.asp?issn=0975-7406;year=2010;volume=2;issue=1;spage=38;epage=43;aulast=Garg 3/6

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Isolation and purification of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

Effect of substrate on chitinase activity T o a n a l y z e t h e e f f e c t o f c o l l o i d a l c h i t i n c o n c e n t r a t i o n o n c h i t i n a s e a c t i v i t y , s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t b y v a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c o l l o i d a l c h i t i n f r o m0 . 0 2 5 t o 0 . 1 5 m l . T h e r e s i d u a l e n z y m e a c t i v i t y w a s t h e n m e a s u r e d u n d e r s t a n d a r d a s s a y c o n d i t i o n s . Effect of crude enzyme on chitinase activity T o d e t e r m i n e t h e p r o d u c t i o n o f c h i t i n a s e a t m a x i m u mc o n c e n t r a t i o n , a n e n z y m e a s s a y w a s c a r r i e d o u t b y v a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f c r u d e e n z y m e f r o m0 . 1 t o 0 . 5 m l a n d a s s a y i n g t h e e n z y m e u s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a s s u b s t r a t e a n d t h e a m o u n t o f [ 1 2 ] N A Gr e l e a s e d w a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f R e i s s i g et al. Protein content determination T h e p r o t e i n c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d i n t h e c r u d e a n d p a r t i a l l y p u r i f i e d f r a c t i o n s a c c o r d i n g t o t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d p r o c e d u r e , [ 1 4 ] b y p l o t t i n g t h e s t a n d a r d c u r v e u s i n g b o v i n e s e r u ma l b u m i n ( B S A ) a s t h e s a m p l e . Separation of proteins by SDS-PAGE
[ 1 3 ] T o d e t e r m i n e t h e p u r i t y a n d m o l e c u l a r w e i g h t o f c h i t i n a s e , S D S P A G E w a s c a r r i e d o u t i n 1 2 %r e s o l v i n g g e l ( 1 . 5 MT r i s H C l p H8 . 8 , D . W, 1 0 %S D S , 1 0 %a m m o n i u mp e r s u l p h a t e ( A P S ) , t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ( T E ME D ) ; 3 0 : 0 . 8 a c r y l a m i d e : b i s a c r y l a m i d e ) a n d 5 %s t a c k i n g g e l ( 1 MT r i s H C l , p H6 . 8 , D . W, 1 0 %S D S , 1 0 %A P S , T E ME D ; 3 0 : 0 . 8 a c r y l a m i d e : b i s a c r y l a m i d e ) .

R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n

P l a n t c h i t i n a s e s h a v e d i f f e r e n t d e g r e e s o f a n t i f u n g a l a c t i v i t y a g a i n s t d i f f e r e n t f u n g i . A l t h o u g h r a p i d a c c u m u l a t i o n o f h i g h l e v e l s o f c h i t i n a s e s ( t o g e t h e r w i t h n u m e r o u s o t h e r p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n s ) o c c u r i n r e s i s t a n t t i s s u e s e x p r e s s i n g a h y p e r s e n s i t i v e r e a c t i o n . In vitro and in vivo chitinase activity In vitro a n d in vivo c h i t i n a s e a c t i v i t y o f R MO4 0 v a r i e t y o f m o t h b e a n p l a n t s a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s , i . e . 0 , 4 , 2 4 , 4 8 , 7 2 a n d 1 6 8 h i n b o t h c o n t r o l a n d i n o c u l a t e d p l a n t s i s g i v e n i n [ T a b l e 1 ] . T h e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e c h i t i n a s e a c t i v i t y i s h i g h e r i n t h e i n o c u l a t e d p l a n t s w h e n c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l . I n in vitro c o n d i t i o n , t h e m a x i m u ma c t i v i t y o f c h i t i n a s e p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d i n 2 4 h a f t e r i n o c u l a t i o n o f m o t h b e a n p l a n t s , w h e r e a s f o r in vivo c o n d i t i o n s m a x i m u mc h i t i n a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n 1 6 8 h . T h i s m a y b e a t t r i b u t e d t o t h e g r a d u a l l o s s o f b i o s y n t h e t i c m a c h i n e r y d u e t o d e t a c h i n g o f p l a n t s i n in vitro c o n d i t i o n s . O n e m a y a l s o a n t i c i p a t e t h a t , o n t h e o n e h a n d , N A Gi s p o s s i b l y u s e d b y f u n g u s a s a n u t r i t i o n a l s o u r c e , b u t o n t h e o t h e r h a n d , g r e a t e r a m o u n t s o f a c c u m u l a t e d N A Gm a y h a m p e r f u r t h e r p r o d u c t i o n o f t h e e n z y m e . F o r in vivo c o n d i t i o n s , t h e d e l a y e d i n c r e a s e i n c h i t i n a s e a c t i v i t y m a y b e d u e t o s l o wa b s o r p t i o n o f t h e f u n g a l s p o r e s a f t e r i n o c u l a t i o n . S o m e r e s e a r c h e r s r e p o r t e d m a x i m u m c h i t i n a s e a c t i v i t y i nB a c i l l u s p a b u l i > KI a f t e r 1 2 0 h i n c u b a t i o n , w h e r e a s i n Aeromonas i t w a s o b s e r v e d o n l y a f t e r 5 0 h [ 1 5 ] , [ 1 6 ] i n c u b a t i o n t i m e . Purification of chitinase enzyme C r u d e c h i t i n a s e e n z y m e e x t r a c t e d f r o mb o t h in vitro a n d in vivo e x p e r i m e n t s w a s p u r i f i e d i n t h r e e s t e p s . I n t h e f i r s t s t e p , c r u d e o c h i t i n a s e e n z y m e w a s h e a t t r e a t e d a t 5 0 Cf o r 2 0 m i n . I n t h e s e c o n d s t e p , 6 0 %s a l t s a t u r a t i o n o f h e a t t r e a t e d s a m p l e w i t h ( N H4 ) S O4 w a s c a r r i e d o u t . I n t h e t h i r d s t e p , t h e i n o c u l a t e d a s w e l l a s c o n t r o l f r a c t i o n s w e r e p a s s e d t h r o u g h s e p h a d e x G 2 5 c o l u m n 2 f o r f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . A f t e r e a c h p u r i f i c a t i o n s t e p , t h e p u r i f i e d f r a c t i o n s w e r e a s s a y e d f o r c h i t i n a s e e n z y m e a c t i v i t y a n d p r o t e i n c o n t e n t o f b o t h c o n t r o l a s w e l l a s i n o c u l a t e d p l a n t s i n b o t h in vitro a n d in vivo c o n d i t i o n s . T h e d a t a a r e g i v e n i n [ T a b l e 2 ] . A g r a d u a l d e c r e a s e i n t h e e n z y m e a c t i v i t y a s w e l l a s t h e p r o t e i n c o n t e n t a f t e r e a c h p u r i f i c a t i o n s t e p h a s b e e n o b s e r v e d . I n in vitro c o n d i t i o n , t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e c r u d e e n z y m e i s 2 0 . 7 5 f o l d w h e n c o m p a r e d w i t h 1 . 0 4 f o l d i n c o n t r o l ( in vitro) . S i m i l a r l y , a h i g h p u r i f i c a t i o n o f 3 2 . 7 8 f o l d w a s o b t a i n e d i n in vivo c o n d i t i o n s w h e n c o m p a r e d w i t h 0 . 3 2 f o l d f o r t h e c o n t r o l . I n in vitro e x p e r i m e n t s t h e e x c i s e d p l a n t s h o w s a n e a r l y i n c r e a s e i n c h i t i n a s e a c t i v i t y w i t h a m a x i m u ma t 2 4 h a f t e r w h i c h i t d e c r e a s e s g r a d u a l l y , a s c o m p a r e s t o 1 6 8 h i n in vivo c o n d i t i o n s . Optimized crude enzyme activity T h e g r a p h o f e n z y m e k i n e t i c s w a s p l o t t e d u s i n g d i f f e r e n t a l i q u o t s o f t h e c h i t i n a s e e n z y m e [ F i g u r e 1 ] . T h e m a x i m u mc h i t i n a s e a c t i v i t y w a s o b t a i n e d u s i n g 0 . 4 m l o f t h e c r u d e c h i t i n a s e e x t r a c t . Effect of temperature and time on chitinase activity
jpbsonline.org/article.asp?issn=0975-7406;year=2010;volume=2;issue=1;spage=38;epage=43;aulast=Garg 4/6

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Isolation and purification of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n c h i t i n a s e a c t i v i t y i s s h o w n i n [ F i g u r e 2 ] , t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r e f o r c h i t i n a s e a c t i v i t y w a s f o u n d a t oCt 4 0 C . Ad r o p i n a c t i v i t y a b o v e 4 0 e m p e r a t u r e w a s p o s s i b l y d u e t o h e a t i n a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e . S i m i l a r t e m p e r a t u r e [ 1 7 ] v a l u e s w e r e d e s c r i b e d f o r t h e p u r i f i e d c h i t i n a s e s f r o mm y c o p a r a s i t i c f u n g i e x c e p t f o r Aphanocladium album. T h e c h i t i n a s e a c t i v i t y d e t e r m i n e d u s i n g c o l l o i d a l c h i t i n a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s r a n g i n g f r o m6 0 t o 1 5 0 m i n i s s h o w n i n [ F i g u r e 3 ] . I t s h o w s t h a t m a x i m u mc h i t i n a s e a c t i v i t y w a s a t 9 0 m i n , w h i c h g r a d u a l l y d e c r e a s e s w i t h t i m e .

Effect of colloidal chitin on chitinase activity T o a n a l y z e t h e e f f e c t o f c o l l o i d a l c h i t i n o n c h i t i n a s e a c t i v i t y , w e v a r i e d t h e v o l u m e o f c o l l o i d a l c h i t i n f r o m0 . 0 2 5 t o 0 . 1 5 m l . T h e e f f e c t o f s u b s t r a t e o n c h i t i n a s e a c t i v i t y [ F i g u r e 4 ] s h o w s t h a t m a x i m u mc h i t i n a s e a c t i v i t y w a s o b t a i n e d u s i n g 0 . 1 m l o f c o l l i o d a l c h i t i n , a f t e r w h i c h i t f a l l s s l i g h t l y . T h i s i n d i c a t e s t h a t c h i t i n a c t i v i t y c o r r e l a t e d w i t h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e r e f o r e m a x i m u m a c t i v i t y w a s r e c o r d e d a t 0 . 1 m l o f c o l l o i d a l c h i t i n v o l u m e i n t h e m e d i u m . Ad r o p i n c h i t i n o l y t i c a c t i v i t y a t 0 . 1 5 m l c o l l o i d a l c h i t i n v o l u m e m a y i n d i c a t e a h i n d e r i n g r e a c t i o n o f c o l l o i d a l c h i t i n s e r v i n g a s s u b s t r a t e , o r a c c u m u l a t i o n o f i n t e r m e d i a t e s t h a t r e s u l t s f r o m c h i t i n d e c o m p o s i t i o n i n t o m e d i u mw h i c h m a k e u p a s y n t h e t i c i n h i b i t o r o f c h i t i n a s e i t s e l f . Determination of protein content P r o t e i n c o n t e n t o f R MO4 0 v a r i e t y o f m o t h b e a n p l a n t s a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s i s g i v e n i n [ T a b l e 1 ] . T h e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e p r o t e i n c o n t e n t i s h i g h e r i n t h e i n o c u l a t e d p l a n t s a s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l . T h e m a x i m u mp r o t e i n c o n t e n t w a s o b s e r v e d i n 2 4 h i n in vitro c o n d i t i o n s , w h e r e a s i n in vivo c o n d i t i o n i t w a s o b s e r v e d i n 1 6 8 h . Separation by SDS-PAGE S D S P A G Ep r o f i l e g i v e s b a n d s o f e x t r a c t e d e n z y m e a t 3 0 k D a [ F i g u r e 5 ] . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d f o r p u r i f i e d c h i t i n a s e f r o mc h i c k p e a i n d u c e d Pseudomonas aeruginosa a n d Fusarium oxysporum w h e r e t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f p u r i f i e d c h i t i n a s e s [ 1 8 ] [ 1 9 ] w e r e 3 1 a n d 6 2 k D a , r e s p e c t i v e l y . T h e r e p o r t e d r a n g e o f c h i t i n a s e i s 2 6 4 3 k D a , w h i c h p r o v e s t h a t t h e i s o l a t e d a n d p u r i f i e d e n z y m e i s c h i t i n a s e . A c c o r d i n g t o t h e c u r r e n t s y s t e mo f c h i t i n a s e n o m e n c l a t u r e , t h e o n e w i t h 3 2 k D a i s a n e x o c h i t i n a s e [ 2 0 ] a n d t h e o n e w i t h 4 8 k D a i s p r i m a r i l y a n e x o c h i t i n a s e , w i t h o n l y s l i g h t e n d o c h i t i n a s e a c t i v i t y . O u r r e s u l t s a r e i n l i n e w i t h f i n d i n g s p r o v i d e d b y t h e a m m o n i u mh y d r o x i d e f r a c t i o n . I t a l s o c o n f i r m s t h a t t h i s s y s t e mo f p u r i f i c a t i o n i s r e p r o d u c i b l e , a s t h e p a t t e r n o f S D S P A G Ew a s n e a r l y t h e s a m e w h e n t h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d .

C o n c l u s i o n

C h i t i n a s e f r o mR MO4 0 v a r i e t y o f m o t h b e a n s ( P. aconitifolius) a g a i n s t t h e f u n g a l p a t h o g e n M. phaseolina s t r a i n 2 1 6 5 c a n b e e a s i l y s y n t h e s i z e d a n d e f f i c i e n t l y p u r i f i e d . T h e c h i t i n a s e i s o l a t e d i n b o t h in vitro a n d in vivo c o n d i t i o n s i s s t a b l e a n d a c t i v e . T h e y i e l d i s s u f f i c i e n t f o r i n i t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n s t u d i e s o f t h e e n z y m e . Wi t h r e s p e c t t o t h e p r e s e n t r e s u l t s a n d c o m p a r i s o n w i t h p r e v i o u s r e p o r t s o n o t h e r c h i t i n a s e p r o d u c e r s , t h i s p l a n t s e e m s t o h a v e t h e c a p a b i l i t y f o r p r o d u c t i o n o f c h i t i n a s e . I t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o s t u d y t h e m o l e c u l a r l e v e l o f t h e c h i t i n a s e e n z y m e , w h i c h c a n m a k e g e n e r a t i n g t h e d e f e n s e m e c h a n i s mi n p l a n t s i n w h i c h i t c a n n o t g e n e r a t e .

R e f e r e n c e s 1 . N a w a n i N N , K a p a d n i s B P , D a s A D , R a o A S , Ma h a j a n S K . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o p h i l i c a n d a c i d o p h i l i c c h i t i n a s e f r o mMicrobispora sp. V 2 . J A p p l Mi c r o b i o l 2 0 0 2 ; 9 3 : 9 6 5 7 5 . 2 . A b e l e s F B , B o s s h a r t R P , F o r r e n c e L E , H a b i g WH . P r e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f G l u c a n a s e a n d c h i t i n a s e f r o mb e a n l e a v e s . P l a n t P h y s i o l 1 9 7 0 ; 4 7 : 1 2 9 3 4 . 3 . B o l l e r T , G e h r i A , Ma u c h F , V o g e l i U . C h i t i n a s e i n b e a n l e a v e s : I n d u c t i o n b y e t h y l e n e , p u r i f i c a t i o n , p r o p e r t i e s a n d p o s s i b l e f u n c t i o n s . P l a n t a 1 9 8 3 ; 1 5 7 : 2 2 3 1 . 4 . L o r i t o M, S h e r i d a n I , Wo o , G a r y E H , S p o s a t o P , Mu c c i f o r a S , et al. G e n e s e n c o d i n g f o r c h i t i n o l y t i c e n z y m e s f r o m b i o c o n t r o l f u n g i : a p p l i c a t i o n s f o r p l a n t d i s e a s e c o n t r o l . V o l . 2 . C h i t i n E n z y m o l o g y . I n : Mu z z a r e l l i R A , e d i t o r . I t a l i a : A t e c E d i z i o n i ; 1 9 9 6 . p . 9 5 1 0 1 . 5 . G u e v a r a G o n z l e z R G , P a c h e c o I T . F u n g a l c h i t i n a s e s . A d v a n c e s i n A g r i c u l t u r a l a n d F o o d B i o t e c h n o l o g y ; 2 0 0 6 . p . 2 8 9 3 0 4 . 6 . L i D C , Z h a n g S H , L i u K Q , L u J . P u r i f i c a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c h i t i n a s e f r o mm y c o p a r a s i t i c f u n g u s Trichothecium roseum. J G e n A p p l Mi c r o b i o l 2 0 0 4 ; 5 0 : 3 5 9 . 7 . T s u j i b o H , Mi n o u r a K , Mi y a m o t o K , E n d o H , Mo r i w a k i M, I n a m o r i Y . P u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a t h e r m o s t a b l e c h i t i n a s e f r o mStreptomyces thermoviolaceous O P C 5 2 0 . A p p l E n v i r o n Mi c r o b i o l 1 9 9 3 ; 5 9 : 6 2 0 2 . 8 . V e r b u r g J G , H u y n h Q K . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a n t i f u n g a l C h i t i n a s e f r o mArabidopsis thaliana. P l a n t P h y s i o l 1 9 9 1 ; 9 5 : 4 5 0 5 . 9 . B h u s h a n B . P r o d u c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o s t a b l e c h i t i n a s e f r o ma n e wa l k a l o p h i l i c Bacillus sp. B G 1 1 . J A p p l

jpbsonline.org/article.asp?issn=0975-7406;year=2010;volume=2;issue=1;spage=38;epage=43;aulast=Garg

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Isolation and purification of fungal pathogen (Macrophomina phaseolina) induced chitinase from moth beans (Phaseolus aconitifolius) Garg N, Gupta H - J P

9 . B h u s h a n B . P r o d u c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a t h e r m o s t a b l e c h i t i n a s e f r o ma n e wa l k a l o p h i l i c Bacillus sp. B G 1 1 . J A p p l Mi c r o b i o l 2 0 0 0 ; 8 8 : 8 0 0 8 . 1 0 . D o n d e r s k i W, T r z e b i a t o w s k a M. I n f l u e n c e o f p h y s i c a l a n d c h e m i c a l f a c t o r s o n t h e a c t i v i t y o f c h i t i n a s e s p r o d u c e d b y p l a n k t o n i c b a c t e r i a i s o l a t e d f r o mJ e z i o r a k L a k e . P o l J E n v i r o n S t u d 2 0 0 0 ; 9 : 7 7 8 2 . 1 1 . Z h a n g Z , Y u e n G Y , S a r a t h G , P e n h e i t e r A R . C h i t i n a s e s f r o mt h e p l a n t d i s e a s e b i o c o n t r o l a g e n t s t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i a C 3 . P h y t o p a t h o l o g y 2 0 0 1 ; 9 1 : 2 0 4 1 1 . 1 2 . R e i s s i g J L , S t o r m i n g e r J L , L e l o i r L F . Am o d i f i e d c o l o u r i m e t r i c m e t h o d f o r t h e e s t i m a t i o n o f N a c e t y l a m i n o s u g a r s . J B i o l C h e m1 9 5 5 ; 2 1 7 : 9 5 9 6 6 . 1 3 . L a e m m l i U K . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e 1 9 7 0 ; 2 2 7 : 6 8 0 5 . 1 4 . L o w r y O H , R o s e b r o u g h N J , F a r r A l , R a n d a l l R J . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J B i o l C h e m 1 9 5 1 ; 1 9 3 : 2 6 5 7 5 . 1 5 . F r n d b e r g E , S c h n r e r J . C h i t i n o l y t i c p r o p e r t i e s o f Bacillus pabuli K I . J A p p l B a c t e r i o l 1 9 9 3 ; 7 6 : 3 6 1 . 1 6 . H u a n g H , C h e n C J , S u Y C , P r o d u c t i o n o f c h i t i n o l y t i c e n z y m e s f r o ma n o v e l s p e c i e s o f A e r o m o n s . J I n d Mi c r o b i o l 1 9 9 6 ; 1 7 : 8 9 . 1 7 . K i n z C , S e l l a mO , B e r t h e a u Y . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c h i t i n a s e f r o mt h e h y p e r p a r a s i t i c f u n g u s Aphanocladium album. P h y s i o l Mo l P l a n t P a t h o l 1 9 9 2 ; 4 0 : 1 1 7 3 1 . 1 8 . S a i k i a R , S i n g h B P , K u m a r R , A r o r a D K . D e t e c t i o n o f p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n s c h i t i n a s e a n d b 1 , 3 g l u c a n a s e i n i n d u c e d c h i c k p e a . C u r r S c i 2 0 0 5 ; 8 9 : 6 5 9 6 3 . 1 9 . v a n L o o n L C , v a n S t r e i n E A . T h e f a m i l i e s o f p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o t e i n s , t h e i r a c t i v i t i e s a n d c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f P R 1 t y p e p r o t e i n s . P h y s i o l Mo l P l a n t P a t h o l 1 9 9 9 ; 5 5 : 8 5 9 7 . 2 0 . Z h a n g Z , Y u e n G Y , S a r a t h G , P e n h e i t e r A R . C h i t i n a s e s f r o mt h e P l a n t D i s e a s e B i o c o n t r o l A g e n t , Stenotrophomonas maltophilia C 3 . P h y t o p a t h o l o g y 2 0 0 1 ; 9 1 : 2 0 4 1 1 .

F i g u r e s [ F i g u r e 1 ] , [ F i g u r e 2 ] , [ F i g u r e 3 ] , [ F i g u r e 4 ] , [ F i g u r e 5 ]

T a b l e s [ T a b l e 1 ] , [ T a b l e 2 ]

C o n t a c t U s | S u b s c r i b e | A d v e r t i s e | S i t e m a p | Wh a t ' s N e w| F e e d b a c k | D i s c l a i m e r J o u r n a l o f P h a r m a c y A n d B i o a l l i e d S c i e n c e s | P u b l i s h e d b y Me d k n o w t hF O n l i n e s i n c e 2 0 e b r u a r y , 2 0 1 0
ISSN : P r i n t 0 9 7 6 4 8 7 9 , O n l i n e 0 9 7 5 7 4 0 6

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