PRÁCTICA # 5

“CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA”

OBJETIVOS:

°Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina, c.c.f., sus características y los factores que en ella
intervienen.
°Calcular valores de Rf de varias sustancias.
°Deducir, a través del Rf la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los
eluyentes utilizados.
°Aplicar la técnica de c.c.f. como criterio de pureza e identificación de las sustancias.

INTRODUCCIÓN:

El botánico ruso Mikhail Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y fue el primero en utilizar este
término. Es recordado como el Padre de la Cromatografía. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para
colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de
Cromatografía de Capa Fina. Egon Stahl (1956) dio el nombre de Cromatografía de Capa Fina. Estandarizó los
procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a la técnica simple, a bajo costo y eficiente.

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En
toda separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se
mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y
los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la
mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la
separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve
rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y
su salida es mucho más lenta.

TIPO FASE ESTACIONARIA FASE MÓVIL

LÍQUIDO - SÓLIDO Sólido inerte como gel de sílice o alúmina disolventes
INTERCAMBIO IÓNICO Resina cambiadora Disoluciones acuosas
LÍQUIDO – LÍQUIDO Líquido adsorbido en un soporte sólido Líquido
GAS - LÍQUIDO Película de líquido adsorbida sobre un soporte sólido gas

Cromatografía de Capa Fina (TLC ó CCF)

La cromatografía de capa fina se conoce normalmente por sus siglas en inglés (TLC, thin layer
chromatography). Es una técnica muy utilizada para la identificación y determinación de pureza de compuestos
También puede utilizarse como técnica de separación (cromatografía de capa fina TLC preparativa) a muy
pequeña escala.
En esta técnica la fase estacionaria es una capa fina de gel de sílice u otro soporte con propiedades
adsorbentes (en nuestro caso de 25 mm de espesor) dispuesta sobre un soporte de vidrio o aluminio que
denominaremos placa. El eluyente o fase móvil será la mezcla de disolventes adecuada.

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente
pequeñas. La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el
principio del reparto entre dos fases. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una
fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con
la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria. La
fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien
fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede
ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de
moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase
estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos.

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la
placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña
cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las
moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de
muestras que se está analizando presenta color, se verán los distintos colores migrando a distintas velocidades.
Si son incoloras hay que someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora (developer)

1
para poder determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador dependerá del tipo de
moléculas que se analizan.
La separación de mezclas complejas de productos y el aislamiento y purificación de los componentes
individuales es de gran importancia en la química orgánica. La cromatografía constituye una importante
herramienta en este sentido, complementaria con las técnicas clásicas: cristalización, destilación, etc.
En la actualidad existe una gran variedad de técnicas cromatográficas a disposición del químico, desde algunas
muy simples: Cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de columna a técnicas mucho más sofisticadas
que requieren equipos de elevado costo: Cromatografía de gases (GC), cromatografía de Líquidos (LC) HPLC,
etc. No obstante, el fundamento de la mayor parte de las técnicas cromatográficas es similar, y su conocimiento
facilita la comprensión de todas ellas.

Proceso de Adsorción: La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción
de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc.). Luego,
cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios
activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de
Capa Fina son:
°Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
°Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
°Tierra Silícea ó Kieselguhr
°Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
°Poliamidas
Estos adsorbentes deber tener las siguientes características:
°Tamaño de Partícula
°Volumen de Poro
°Diámetro de Poro
°Área Superficial
°Homogeneidad
°Pureza

1. Aplicación de la muestra

La introducción de la muestra se realiza utilizando un tubo capilar. Para ello se ha de disolver una pequeña
cantidad de la muestra a analizar en un disolvente volátil. A continuación, el extremo del tubo capilar se
introduce en la disolución. La disolución ascenderá por el tubo por capilaridad. En uno de los lados de la placa,
aproximadamente a 3 mm del borde, se ha de trazar a lápiz una línea recta, línea base, y sobre ella unos puntos
de referencia. Sobre dichos puntos se pincha con el tubo capilar, de modo que una pequeña cantidad de la
disolución pase a la placa. De esta manera, la muestra queda adsorbida por el soporte sólido en la placa.

2. Realización del cromatograma: Correr una placa.

El cromatograma se realiza en una cubeta que contiene el eluyente elegido. El nivel del eluyente debe de ser
menor que la separación entre el borde de la placa y la línea base el lugar donde se ha efectuado el pinchazo.
La placa se introduce en la cubeta y se tapa. El eluyente asciende por la placa por capilaridad, arrastrando a su
paso a los componentes de la mezcla. Naturalmente los componentes de la mezcla son arrastrados con
diferente velocidad, de acuerdo con su distinta polaridad. Cuando el frente del eluyente llega casi al borde
superior de la placa, esta se extrae de la cubeta. Se debe de trazar una nueva línea a lápiz indicando el nivel
hasta el que el ha ascendido el eluyente.

3. Revelado del cromatograma

Una vez que el eluyente sobre la placa se ha secado se ha de proceder a la visualización del cromatograma. En
determinados casos, si los compuestos son coloreados esto puede realizarse de forma directa. Sin embargo,
para compuestos incoloros es necesario utilizar diferentes técnicas de revelado.
Las placas de cromatografía comerciales portan un agente fluorescente inorgánico en la fase estacionaria. Ello
permite visualizar el cromatograma iluminando la placa con una lámpara de luz ultravioleta UV. Los diferentes
compuestos aparecen en la placa como manchas circulares. Las distintas manchas deben de marcarse a lápiz
sobre la placa para su estudio posterior.
Diferentes reactivos orgánicos también permiten el revelado permanente de la placa, obteniéndose manchas
coloreadas en ella. De entre los métodos más comunes puede destacarse la utilización del Iodo. Para ello la
placa se introduce en una cubeta que contiene cristales con Iodo y se deja estar en ella durante unos minutos.
Los vapores de iodo se disuelven en las manchas de los compuestos orgánicos tiñéndolas de color marrón.

4. Interpretación: factor de retención R f

2
 Una vez que la placa ha sido revelada nos encontramos con una serie de manchas circulares. Si la separación
ha sido buena cada una de ellas se corresponderá a un único compuesto de la mezcla inicial.
Es importante tener en cuenta que un mismo compuesto corre siempre de la misma forma en cromatogramas
realizados en las mismas condiciones (mismo soporte y mismo eluyente). Para describir las propiedades
cromatográficas de cada compuesto se define el factor de retención Rf.
El factor Rf es el cociente de la distancia recorrida por el compuesto (dc) entre la distancia recorrida por el
eluyente (de). Obviamente el Rf toma valores entre 0.0 y 1.0. Siempre ha de indicarse el eluyente y el soporte en
el que se ha determinado.
dc
Rf =
de
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA:

Polaridad

La mayor o menor velocidad de desplazamiento a lo largo de la columna depende directamente de la estructura

de cada molécula así como de los grupos funcionales que pueda poseer. El motivo principal es su diferente
polaridad. Moléculas más polares quedan más retenidas en la fase estacionaria, es decir "corren menos",
mientras que las moléculas menos polares se ven menos retenidas y avanzan a mayor velocidad arrastradas
por eluyente.

Elección del eluyente

La polaridad de la mezcla de disolventes - eluyente - utilizado es clave para obtener una buena separación.
Eluyentes más polares arrastran más fácilmente a los compuestos, es decir los compuestos "corren más" en
eluyentes más polares. Por el contrario, mezclas de disolventes con poca polaridad desplazan los compuestos a
través de la columna con mayor lentitud.
La polaridad relativa de los disolventes más usuales se encuentra relacionada en una tabla denominada "serie
eluotrópica" (polaridad creciente de izquierda a derecha): hexano, ciclohexano, tolueno, éter, cloroformo,
diclorometano, THF, acetato de etilo, acetona, etanol, metanol, agua.
De nuevo, es importante recordar que en la elección adecuada de la mezcla de disolventes radica el éxito de la
separación en la cromatografía de revelado.
Las placas de cromatografía comerciales portan un agente fluorescente inorgánico en la fase estacionaria. Ello
permite visualizar el cromatograma iluminando la placa con una lámpara de luz ultravioleta UV. Los diferentes
compuestos aparecen en la placa como manchas circulares. Las distintas manchas

Por su simplicidad y rapidez, la cromatografía de capa fina es una herramienta muy valiosa en el análisis en el
laboratorio de química orgánica. Algunas de sus aplicaciones son:
∼ La identificación de compuestos conocidos en una mezcla por comparación del cromatograma de la mezcla
con el del compuesto conocido.
∼ La determinación del final de una reacción química: la desaparición de la mancha correspondiente al producto
de partida indica la conclusión de la reacción.
∼ Criterio de pureza: la existencia de una o varias manchas en el cromatograma indica la presencia de uno o
varios productos.

= PARTE EXPERIMENTAL=

MATERIAL CANTIDA MATERIAL CANTIDA

D D
Placas p/cromatografía (portaobjetos) 6 Probeta de 25 ml 1
Matraces erlenmeyer de 10 ml o 5 Frasco cámara 5
viales 2 Agitador de 1
Pipeta graduada de 10 ml vidrio 4
Capilares 1
Espátula

SUSTANCIAS

3
 p-hidroxiacetanilida acetato de etilo
m- yodo
nitroclorobenceno sulfato de sodio
benzoina anhidro
hexano nipagin
metanoletanol nipasol
acetona

PROCEDIMIENTO:

Experimento 1. Polaridad de las sustancias.

Es un experimento comparativo en el que se desea saber cual sustancia es más polar y cual menos polar. Para
ello se le proporcionará a usted las soluciones 1 y 2. Prepara tres cromatoplacas y aplique estas soluciones en
cada una de ellas.
Eluya la primera cromatoplaca con hexano, la segunda con AcOet y la tercera con MeOH.
En cada caso, deje evaporar el eluyente y revele con luz ultravioleta, observe y anote sus resultados, luego
revele con yodo, observe nuevamente

Experimento 2. Pureza de las sustancias.

Se desea saber cuál sustancia es pura y cuál es impura.

Para ello se le proporcionará a usted las soluciones 3 y 4.
Prepare una cromatoplaca y aplique en ella ambas soluciones por separado, como en el experimento anterior.
Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V. y luego con yodo. Anote sus observaciones.

Experimento 3.Influencia de la concentración.

Se desea saber cuál es el efecto de la concentración de una sustancia en c.c.f. Para ello se le proporcionará a
usted la solución 5.
Prepare una cromatoplaca y en ella haga tres aplicaciones de esta solución en orden creciente de
concentración
Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V. y luego con yodo en cada caso observe la intensidad de la
coloración de las manchas.
Con base en lo anterior, deduzca la relación que existe entre la intensidad de la coloración de las manchas y la
concentración de la sustancia en cada caso.

Experimento 4. La c.c.f. como criterio parcial de identificación.

Se desea identificar los componentes de una mezcla, por medio de su comportamiento en c.c.f. y comparándolo
con el de la sustancia estándar bajo las mismas condiciones experimentales. Para esto, se le proporcionará a
usted las soluciones 6A y 6B. En este caso son soluciones de nipagin y nipasol, respectivamente.
Prepare dos cromatoplacas y en ambas haga las siguientes aplicaciones: solución, solución mezcla (1:1) de 6ª y
solución. Luego, eluya una de las cromatoplacas con AcOEt revelando con luz U.V. y luego con yodo.
La otra cromatoplaca elúyala varias veces (4 por lo menos) con un eluyente menos polar, por ejemplo una
mezcla de hexano-AcOEt (4:1), dejando secar la placa entre una elución y otra. Observe la placa a la luz U.V.
después de la cuarta elución. Si después de la cuarta elución la mezcla no se separa, sigue eluyendo hasta
lograr la separación. Finalmente revele con yodo.

RESULTADOS:

Experimento 1. Polaridad de las sustancias.

Eluyentes:
a) MeOH b) AcOet c) Hexano

4
Nueva posición del compuesto Frente del disolvente:
a) 12.7 Y 2 2.6 3.0
b) 12.7 y 2  2.5 2.75
c) 1 0.1 y 2 0.1 0.5
Posiciones relativas de los puntos:
2.7 2.6
R f a1 = = 0.9; R f a 2 = = 0.8666
3.0 3.0
2.7 2.5
R f b1 = = 0.9818; R f b 2 = = 0.9091
2.75 2.75
0.1 0.1
R f c1 = = 0.2; R f c 2 = = 0.2
0.5 0.5
Con base en los resultados obtenidos, conteste:

a. ¿Cuál es el eluyente adecuado? ¿por qué? El Metanol tiene una polaridad mayor y como las
sustancias tienen polaridades similares en un eluyente mas polar se podrá obtener la separación mas
notoria, además de que el disolvente más polar es el que arrastra mejor a los componentes de la
mezcla, además de que los mejores eluyentes son los que tienen la posición relativa media al ser
comparado
b. ¿ Cuál es la sustancia más polar? ¿por qué? La 2 ya que la sílica gel al ser polar adsorbe al
componente más polar y fue el eluyente que alcanzo menor distancia.
c. ¿Cuál es la sustancia menos polar? ¿Por qué? La 1 ya que avanzo a través de la sílica

Experimento 2. Pureza de las sustancias.

Se realizó 2 veces:

a) Eluyente: AcOet b) Eluyente: Hexano/ AcOet (4:1)

Nueva posición del compuesto Frente del disolvente:

a) 3 2.7 4 2.7 3.0
b) 31.3 4 1.5 1.9

¿Cuál es la sustancia pura y cuál es la impura? El experimento como ya se observo se realizó 2 veces, sin
embargo en ninguna de las 2 muestras se observaron manchas adicionales, por lo que se les consideraría
“puras”, pero como sabemos de anterioridad una de las 2 se encontraba impura por lo cuál se considero que el
experimento no tuvo éxito.

Experimento 3.Influencia de la concentración.

Eluyente: AcOet

5
 Nueva posición del compuesto

• 1GOTA = 2.8
• 3GOTAS = 2.9
• 6 GOTAS= 2.9

Frente del disolvente: 3.1

Experimento 4. La c.c.f. como criterio parcial de identificación.

M = 6A + 6B
a) Eluyente: AcOet b) Eluyente: Hexano /AcOet (8:2)

AcOet Hex /AcOet (8:2)

6ª M 6B 6ª M 6B
2.8 2.2 2.0 1.8 1.9 1.8
2.5 2.7 2.8 2.1 2.2 2.2
- - - - - 2.6

Frente del disolvente

3.1 2.8

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

 En el experimento 1 se determino la polaridad de las sustancias problema y así mismo el eluyente

más adecuado sonde se observó que de las 3 placas el mejor eluyente sería el metanol ya que es el
disolvente más polar y arrastra más fácilmente a los compuestos y además de que al hacer la
comparación entre placas es el que quedó a la mitad. Esto en comparación con el menos polar que
fue el hexano ya que este casi no arrastro a los componentes. Y la sustancia más polar fue la 2 ya
que avanzó menos ya que la sílica gel atrae a la sustancia más polar debido a que esta es muy
polar y hace que el compuesto quede retenido en ella, además de que las moléculas más polares
quedan retenidas en la fase estacionaria, es decir, corren menos mientras que las moléculas menos
polares (como la sustancia 1) se ven menos retenidas y avanzan a mayor velocidad arrastradas por
el eluyente.
 En el experimento 2 se pretendía determinar la pureza de una de las 2 sustancias observando la
existencia de una o más manchas en el cromatograma que indicaría la presencia de uno o varios
productos indicando si se encontraba un único compuesto su pureza, sin embargo se realizaron 2
pruebas utilizando distintos eluyentes y en ninguna de las 2 pruebas se observo una mancha
adicional aunque como ya sabíamos que debería haber salido una, y no salio, determinamos que el
experimento no fue satisfactorio.
El experimento 3 se realizó una prueba de cómo influye la concentración en la pigmentación ya que
el compuesto más concentrado se hace más grande y se aprecia mejor que en este caso fue el
tercero que contenía 6 gotas de la sustancia y fue el que se observó la mancha más grande.
Para el experimento 4 se realizaron 3 elusiones repetitivas para separar las mezclas de eluyentes
de baja polaridad, observando como conforme avanzaba la reacción las manchas ya no aparecían

6
indicando así la conclusión de la reacción y agotando así al producto. Para el eluyente AcOet solo
se observaron 2 capas de manchas, por lo que en la tercer elución ya se había agotado el producto.
Para el Hex /AcOet solo en la sustancia 6B se observó una tercera capa ya que en esta aún no se
había agotado la reacción y por lo tanto la sustancia.

CUESTIONARIO:

1. En el experimento 1, ¿Cuál de las sustancias, la más polar o la menos polar, recorre mayor distancia en
la placa a partir del punto de aplicación? ¿Por qué? La menos polar recorre mayor distancia debido a que
el eluyente utilizado la arrastro a mayor velocidad debido a que es menos polar y fue desplazada por la
fase móvil y no se quedo retenida en la fase estacionaria
2. En el mismo experimento calcule los valores de R.f. y contestar ¿Cuál de las dos sustancias tiene
R.f.mayor y cuál menor? Rf mayor: la 1 y Rf menor la 2
a) Rf sustancia 1 = 0.9
Rf sustancia 2 = 0.8666
b) Rf sustancia 1 = 0.9818
Rf sustancia 2 = 0.9091
c) Rf sustancia 1 = 0.2
Rf sustancia 2 = 0.2
3. En el experimento 3 ¿Cuál es la relación que existe entre la concentración y la intensidad de la
coloración de la mancha de una sustancia en una c.c.f.? Mientras mas concentrada sea la solución mayor
será la intensidad de la mancha y más grande será esta es decir es directamente proporcional
4. En el experimento 4, ¿Cuál de las dos formas de elusión permitió mayor separación de la mezcla?, ¿A
qué se debe esto?. En la concentración 6B con Ac de Etilo/Hexano se logro obtener una mejor
observación de las tres fases debido a que el disolvente mezclado disolvió cada una de las fases por
separado ya que con un mismo disolvente solo se logro visualizar una fase debido a las polaridades de
las sustancias
5. ¿Por qué la c.c.f. es un criterio parcial y no total de identificación? Por que la c.c.f. solo indica la
cantidad de sustancias que se encuentran en la muestra inicial, o sus impurezas, además de de
indicarnos la polaridad de dichas sustancias junto con nuestro eluyente demostraremos si se trata de
sustancias muy similares en cuanto a sus propiedades.
6. ¿Cuál será el resultado de los siguientes errores en cromatografía en capa fina?
a) Aplicación de solución muy concentrada: La muestra se mostrara con mayor coloración a la hora de
obtener los resultados de la cromatografía es por eso que debemos tener una muestra con una
concentración media para que sea visible pero no demasiado como para que no podamos distinguir sus
fases
b) Utilizar eluyentes de alta polaridad: La polaridad del eluyente nos indica el desplazamiento que
nuestras muestras pueden alcanzar en la placa de estudio (sílica gel) es por eso también que debemos
cuidar el eluyente para poder analizar correctamente nuestra muestra
c) Emplear una gran cantidad de eluyente en la cámara de cromatografía: esto provocara que nuestra
muestra se diluya demasiado lo que generaría un error considerando el tamaño de nuestra placa
debemos considerar una cantidad moderada para evitar el desplazamiento innecesario de la muestra.
7. Una serie de colorantes es separada por cromatografía en capa fina. Calcular los valores de Rf de cada
colorante de acuerdo a la siguiente tabla.
Colorantes Distancia recorrida por el colorante Distancia recorrida por el eluyente (mm)
(mm)
Rojo de 56.0 70
metilo
Rodamina 38.0 65
Rojo Congo 0.5 72

Rf
Rojo de Metilo 0.8
Rodamina 0.5846
Rojo Congo 0.0069
8. ¿Qué tratamiento es necesario darle a la sílica gel para reutilizarla?La silica gel (Dióxido de Silicio)
tiene la propiedad de absorber las humedad o las sustancias mejor conocido como deshidratador es por
eso que es necesario someterlo a un calentamiento para que este expulse la humedad que se encuentra
dentro de esto y así utilizarlo nuevamente

CONCLUSIONES:

En esta práctica logramos conocer y aplicar la cromatografía por capa fina, sus características y los
factores que influyen en la separación por cromatografía, además de aprender a calcular los valores
del factor de retención de las sustancias para poder deducir la relación que existe entre la polaridad
de las sustancias que se analizan con la de los eluyentes que se utilizan con ellas y así mismo poder

7
aplicar un criterio para identificar la pureza de sustancias de acuerdo con la pigmentación (es) que
estas presenten al realizar la cromatografía.

BIBLIOGRAFÍA:

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm(9/oct/2006)
http://www.fq.uh.cu/dpto/qi/Aimee/sintesis_inor_web/conf_3.htm (28/ago/2006)
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Allier Rosalía etal LA MAGIA DE LA QUÍMICA editorial EPSA, México DF 1995 1º edición pp123 - 124