METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE I ANALIZ

1. Scurt istoric Metoda cromatografic a fost iniiat de botanistul rus vet M. ( ntalnit si Tswet) care a separate pigmeni vegetali printr-o coloan umlput cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul c iniial a folosit-o pentru separarea unor colorani (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greac). Domeniul de aplicaie al cromatografiei s-a extins i s-a diversificat foarte mult, denumirea rmnd consacrat prin folosina i sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferenial ntre doua faze dintre care una staionar, iar cealalt mobil. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat n etape, pe masur ce apreau noi lucrri ce introduceau modificri n metodologia operaional. Cromatografia cu dou faze lichide iniiat de ctre Martin i Synge pentru separarea aminoacizilor acetilai, obinut din distribuia acestora ntre o faz staionar format din silicagel saturat cu ap i o faz mobil constituit din cloroform n amestec cu n-butanol. Ulterior, n acest tip de analiz, au fost folosite faze staionare mai puin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima faz constituind metoda cromatografic cu faze inversate.

Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separri de amestecuri complexe din substane anorganice , organice sau compui hidrosolubili biologici. Cromatografia pe hrtie de filtru de calitate superioar, care permite abordarea analizei la scar microanalitic, a fost iniiat de Consden, Gordon i Martin. Izmailov i Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subire, care se dezvolt mai ales dup perfecionrile introduse de Stahl. Fracionarea cromatografic pe coloana umplut cu gel a luat mare amploare n ultimul timp, sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere- difuzie, metod propus de Porath i Flodin. Cromatografia n faz gazoas a fost descris prima dat de James i Martin, deschiznd noi domenii de aplicaii ale cromatografiei, fiind una dintre cele mai rspndite i mai eficace tehnici de analiz att n cercetare ct i n industrie. Electroforeza, att de binecunoscuta azi este o alt metod eficient al crei principiu este reprezentat de separarea particulelor ncrcate relizat prin migrarea lor difereniat n cmp electric.

2. Noiuni generale Cromatografia este o metod de separare i analiz a subsanelor chimice din amestecuri , care se bazeaz pe interaciunea difereniat a doi sau mai muli compui de separat (numii soluii) cu dou faze cromatografice: faza staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) i faza mobil (aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze). Indiferent de natura chimic sau starea de agregare, faza staionar se gsete intr-o pronunat stare de dispersie (n stare fin divizat) pentru a oferi o suprafa de contact ct mai mare.
2

Ca mecanism de separare, orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a cror direcie se deplaseaz n sens favorabil separrii i eluiei ( procedeu chimic prin care se elibereaz o substan de pe absorbantul su prin splare) de pe suportul cromatografic. Avantajele cromatografiei ca metod de separare: a) permite separarea, identificarea i dozarea cantitativ simultan a componentelor unui amestec; b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practice orice produs organic putnd fi separate printr-o metod cromatografic; c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicat, ceea ce nseamn c necesit doar cantitate foarte mic de prob. n acelai timp ns, se pot aplica i la scar preparativ; d) durata analizei este redus, comparativ cu alte metode de analiz ale amestecurilor complexe.

3. Principiul cromatografiei sau al separrii cromatografice Principiul cromatografiei const n distribuia inegal a componentelor unui amestec intre faza mobil i faza staionar. Amestecul strabate sistemul cromatografic , fiind antrenat de ctre faza mobil. Distribuia inegal este determinat fie de afinitatea diferit a componentelor amestecului fa de cele dou faze, fie de capacitatea diferit de a difuza n acestea.

Principiul este ilustrat n Figura 1, pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa n strat foarte subtire pe peretii coloanei.

Figura 1- Principiul separrii cromatografice. Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc n momentul initial

amestecate, ntr-un volum restrns, vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila n faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute n aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va nregistra o ramnere n urma a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc n timpul deplasarii n coloana, deci este in proces dinamic.

4. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face lund n considerare o serie de criterii, cum sunt: starea i natura probei de analizat, mediul de absorbie (lichid, solid, hrtie, etc), configuraia sistemelor cromatografice, etc.
4

a) n funcie de mecanismul ce st la baza procesului elementar de separare i dup natura celor dou faze, metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie, n care fenomenul principal care sta la baza separri este adsorbtia, iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este n functie de coeficientii lor de adsorbtie. Cromatografie de repartitie, n care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face n funcie de diferena dintre coeficienii lor de repartitie ntre cele doua faze. Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediara ntre cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie, fiind o combinare a acestora. Cromatografia de schimb ionic, care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia, iar separarea componentelor se face n functie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel), n care fenomenul principal este difuzia, iar separarea se face n functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografia de bioafinitate, n care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. De asemenea, n practica cromatografica se ntlnesc si variante intermediare sau mixte ntre aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie, care sunt nsa mai putin uzuale.

b) Clasificarea n funcie de natura fazelor cromatografice, cu condiia ca ca cele dou faze selecionate in prealabil s fie nemicabile, iar una din ele s fie mobil, i anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC); gaz-lichid (GLC); cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). De asemenea, se mai ntlnete i cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) n denumirea creia nu se face refrire la natura fazei staionare. c) Clasificarea n funcie de configuraia sistemului cromatografic este de dou tipuri: cromatografie pe coloan: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutur); cromatografia pe coloane capilare; cromatografie planar: cromatografie n strat subire; cromatografie pe hrtie.

5. Schema de principiu a cromatografului

Schema de principiu a cromatografului este prezentat n Figura 2. Faza mobil care se gaseste ntr-un rezervor de faz mobila 1 trece printr-un dispozitiv de msurare i reglare a debitului 2, apoi ajunge n dispozitivul pentru introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de ctre faza mobil, proba fiind n continuare transportat prin coloana cromatografic 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se gsete n mod uzual ntr-o incint termostatat (cuptor n cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza s se desfoare la o temperatur stabilit. Componentele separate ajung n detectorul 5, unde fiecare component este pus n eviden sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt nregistrate de un nregistrator 6 sau reprezint semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor. 1 - rezervor faza mobil 2 - dispozitiv de reglare i msurare a debitului 3 - dispozitiv de introducere a probei 4 - coloana cromatografic 5 - detector 6 - nregistrator sau integrator

Figura 2. Schema de principiu a cromatografului

7

Diagrama

care

reprezint

rezultatul

analizei

cromatografice

se

numete

cromatogram. Ea este nregistrat n general ca o funcie a intensitii semnalului detectorului n raport cu timpul. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare n cromatograma se numeste pic cromatografic, iar aria picului este proporional cu concentraia componentei respective. n cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hrtia pe care a avut loc analiza, iar componentele sunt evideniate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatogramp este data n Figura 3.

Figura 3. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta cte o componenta separata.

6. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare; moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport, din care este efectuata o coloana; peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii coninui n coloan; proteina este apoi eluat, fie prin modificarea conditiilor din coloan (modificarea pH-ului sau concentratiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra n competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de liganzi n funcie de substana de purificat: substrat, inhibitor, cofactor (pentru enzime), antigene (pentru anticorpi), secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se ataeaz covalent o specie reactiv exist mai muli termeni care l definesc, cum ar fi: matrice, suport solid, suport insolubil, gel. Matricea este un suport solid insolubil, ce prezint o serie de grupri care pot stabili o serie de legturi de tip covalent (M). Ligandul (L) este o substan reactiv care se leag covalent la matrice direct sau indirect i poate recunoate si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent, teoretic, o singur molecul. ntre ligand i molecul exist interacii de tipul celor existente ntre enzim i inhibitor, ntre antigen i anticorp etc. Ligandul poate fi substrat, inhibitor, coenzim i chiar enzim sau alt protein cu funcie biologic. Braul de spaiere (spacer - S) este interpus ntre matrice i ligand, pentru a evita mpiedicrile sterice de legare a substanei la ligandul L. Gruparea conector (C) este o grupare implicat n reaciile de cuplare: matrice-ligand, matrice-spacer-ligand, matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. Principiul cromatografiei de afinitate are la baz ataarea covalent a ligandului la suportul insolubil, adic matricea, i mpachetarea acestui suport ntr-un strat cromatografic.
9

Ca exemplu, dac un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloan, numai acea protein care manifest o bioafinitate pentru ligand va fi reinut. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereinute. Proteina absorbit specific poate fi ulterior eluat prin modificarea compoziiei solventului, pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. Utilizri ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicat dac o interacie specific poate fi stabilit ntre dou tipuri de biomolecule, drept pentru care aplicaiile acestui tip de cromatografie la purificarea i separarea macromoleculelor de interes biologic sunt, teoretic, nelimitate. n acest fel, pot fi selectai adsorbani specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor, acizilor nucleici, cofactorilor i proteinelor implicate n diferite procese de recunoatere biologic. Tehnica poate fi utilizat pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare, precum celule, organite celulare i virusuri. Ca i aplicaii practice ale cromatografiei de afinitate: purificarea unor proteine cum ar fi: enzime, anticorpi, proteine de legare, proteine de transport, proteine receptor, proteine represor; procedee de separare: celule, virusuri, acizi nucleici i nucleotide

complementare, izoenzime, proteine denaturate i modificate chimic, proteine mutant, peptide marcate pentru afinitate; concentrarea de soluii proteice diluate; studii cinetice i a unor mecanisme de legare; determinarea constantelor de disociere i de echilibru.

10

Ca i aplicaie practic, cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metod de separare a celulelor in subpopulaii pe baza proprietilor lor de suprafa, stabilindu-se interacii reversibile biospecifice ntre suportul de afinitate i un component (ligandul) de pe suprafaa unui tip de celule. Astfel, iniial se realizeaz o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mrimea sau densitatea celular, izolndu-se o fracie a populaiei celulare, care apoi este supus cromatografiei de afinitate. n acest mod, celulele care au la suprafa ligandul sunt adsorbite, cellalt tip de celule fiind eluate liber, astfel avnd loc prin modificarea condiiilor cromatografice, disocierea interaciilor celul-ligand. Separrile de celule se realizeaz pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lsa ntre acestea spaii largi ce permit trecerea celulelor. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um.

BIBLIOGRAFIE: 1. Peter Francisc, Timioara, 2005. 2. Iga. D.P., Chimie bioorganic, Editura Universitii din Bucureti, 1996. 3. DEX, Dicionarul explicativ al limbii romne, ediia a III-a, Academia Romn, Institutul de Lingvistic Iorgu Iordan - Alexandru Rosetti, Editura Univers Enciclopedic, 2009. Metode cromatografice de separare i analiz, Universitatea din

11

4. Jercan Elena, Analiza cromatografic, Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti, 1982. 5. Jercan Elena, Metode de separare n chimia analitic, Editura tehnic, Bucureti, 1983. 6. http://www.scribd.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. 7. Dana Iordachescu, Analize biochimice speciale, Bucureti, 1987

12