IDENTIFICACIN de microorganismos especficos

Durante el proceso de fabricacin,

almacenamiento y uso, los medicamentos no estriles son susceptibles de contaminarse con diversos microorganismos.
Representa un riesgo para la salud del usuario. Conlleva a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado.

Es por ello, que las materias primas

y los productos farmacuticos terminados, deben ser sometidos a un anlisis microbiolgico.

Para demostrar que cumplen con ciertas especificaciones establecidas por los organismos oficiales, con el fin de garantizar que los productos son adecuados para el uso al que estn destinados.

El control microbiolgico de las materias primas y de los productos farmacuticos no estriles, involucra la realizacin de dos tipos de ensayos: Recuento total de bacterias aerobias mesfilas y/o recuento de mohos y levaduras.

Investigacin de indicadores especficos.

La FEUM (2012) establece la bsqueda de moo epecficos que son indeseables en las preparaciones farmacuticas.

Escherichia coli Staphylococcus aureus Salmonella sp. Pseudomonas sp.

No se incluyen a todos los patgenos posibles.

EJEMPLO
La categora de medicamentos orales que contienen antibitico

deben cumplir las siguientes caractersticas microbiolgicas: - No mas de 100 UFC en 1g o en 1 ml. - No Pseudomonas aeruginosa.

- No Staphylococcus aureus.
- No Enterobacterias. - No Candida sp

Escherichia coli

Indicador de contaminacin fecal del agua, materiales, o superficies. Por si misma puede ser patgena.

Staphylococcus aureus

Contaminacin de origen humano Importante patgeno

Salmonella

Produce gastroenteritis o bacteriemia. Proviene del intestino de humanos o animales infectados o compuestos vegetales.

Pseudomonas

Patgenas oportunistas que producen infecciones graves y resistentes. Los productos contaminados pueden presentar cambios fisicoqumicos con deterioro en su composicin.

OBJETIVO
Conocer e identificar a los moo objetables que sirven de indicadores de contaminacin en productos farmacuticos no estriles mediante su siembra en medios diferenciales y selectivos y pruebas bioqumicas.

PROCEDIMIENTO

Sembrar las cepas tipo en placas de AST. Incubar 24h a 37C

Realizar frotis de cada cepa y teir por la tcnica de Gram

A partir del crecimiento obtenido sembrar en los medios de cultivo selectivos y/o diferenciales para cada moo

Incubar a 37C durante 18-24 h

Revisar morfologa colonial caracterstica en cada medio

Realizar la lectura de las pruebas bioqumicas.

S. aureus

P. aeruginosa

Salmonella sp.

E. coli

SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS U DIFERENCIALES SIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUMICAS

Baird Parker Vogel Johnson Sal manitol Catalas a Coagulas

a

Cetrimida Ps P Ps F Catalas a Oxidasa

Verde brillante XLD

Sulfito de Bismuto Catalasa TSI SIM VP CS

Mc Conkey EMB

Catalas a TSI SIM VP CS

Manitol

Staphylococcus aureus
cocos gram positivos, anaerobios faciltativos, agupacin en racimos, factor de cuagulacin y agregacin, no son mviles.
Medios de cultivo: Baird Parker Vogel Jhonson Agar sal y manitol Pruebas bioqumicas: Catalasa Coagulasa Manitol

BAIRD PARKER
Medio selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva.

Selectivo debido al telurito de potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompaante.

Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisceo-negro, y dan reaccin sobre la yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara mas externa.

VOGEL JHONSON
Medio utilizado para la rpida deteccin de estafilococos coagulasa positivo fermentadores de manitol.
Diferencial: manitol, carbohidrato fermentable. Rojo fenol, indicador de pH. Selectivo: telurito, el cloruro de litio y la alta concentracin de glicina, inhiben el desarrollo de la flora acompaante.

Los estafilococos coagulasa positivo, fermentan el manitol, produciendo un viraje del indicador de pH a color amarillo, y tambin reducen el telurito a teluro.

AGAR SAL Y MANITOL

Medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.

Manitol como carbohidrato fermentable

Rojo fenol es el indicador de pH Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura.

Pseudomonas aeruginosa
bacilos gram negativos, mvil con flagelo(s) polar(es), aerobio estricto .

Medios de cultivo: Agar cetrimida Agar Ps P Agar Ps F Pruebas bioqumicas: Oxidasa Catalasa

AGAR CETRIMIDA (CET)

Selectivo: La frmula est desarrollada para favorecer la seleccin de P. aeruginosa y estimular la formacin de pigmentos. El cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor Diferencial: Las colonias caractersticas presentan una pigmentacin verde plido espontnea y fluorescencia verde bajo luz ultravioleta.

AGAR PSEUDOMONAS P (PSP)

Diferencial: Permite el crecimiento de especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de piocianina. Selectivo: La glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de fluorescena.

AGAR PSEUDOMONAS F (PSF)

Frmula:

Diferencial: Medio para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de fluorescena. Selectivo: En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina.

Peptona Cloruro de magnesio Sulfato de potasio 10,0 Glicerol Agar

20,0 g 1,4

10,0 15,0

Salmonella sp.
Bacilo Gram negativo, mvil con flagelos pertricos. Son aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados mesfilicos

Medios de cultivo: Agar verde brillante Agar sulfito de bismuto Agar XLD Pruebas bioqumicas: Catalasa TSI SIM VP CS

Agar verde brillante

El verde brillante acta como inhibidor de bacterias Gram positivas y de la mayora de bacterias Gram negativas MEDIO ALTAMENTE SELECTIVO Permite evaluar la presencia de Salmonella diferentes a la S. typhi y S. paratyphi La lactosa y la sacarosa son los carbohidratos fermentables. El rojo de fenol es un indicador. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar es adicionado como agente solidificante.

AGAR XLD

(XYLOSE-LYSINE-DESOXYCHOLATE)

Medio selectivo y difencial. Selectivo: utiliza el desoxicolato de sodio, inhibe los microorganismos gram positivos.
Diferencial: la xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prcticamente todos los entricos, excepto Shigella.

Las colonias tpicas de la Salmonella son de color rojo con el centro negro debido a la produccin de H2S. Mientras que las de E. coli son grandes, amarillas con o sin precipitado de bilis.

SULFITO DE BISMUTO(SB)
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella typhi y otros bacilos entricos.
El sulfato ferroso acta como indicador

en la produccin de sulfuro de hidrgeno que se manifiesta en el centro de la colonia por un precipitado negro y un halo negro grisceo con brillo metlico.
Selectivo: El sulfito de bismuto y el

verde brillante inhiben el crecimiento de bacterias contaminantes

Escherichia coli
Bacilos Gram negativos, 2-3 , no esporulados, mviles, cpsulado, poseen fimbrias, flagelos pertricos, aerobios y anaerobios faculttivos.

Medios de cultivo: Agar EMB Agar Mac Conkey Pruebas bioqumicas: Catalasa TSI SIM VP CS

EMB
Selectivo: la presencia eosina y azul de metileno inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Diferencial: la lactosa y/o sacarosa, estan presentes para evaluar las bacterias fermentadoras de las no fermentadoras. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.

AGAR MACCONKEY
Selectivo: contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el

desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes.

Diferencial: Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias

de diferentes tonos de rojo. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes. El indicador es el rojo neutro.

PRUEBA DE CATALASA
La catalasa es una enzima que descompone al perxido de hidrgeno en oxgeno y agua.

La mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.

Catalasa (+):

Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp. Catalasa (-): Streptococcus spp.

PRUEBA DE OXIDASA
La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa. El sistema de citocromos est generalmente presente en organismos aerbicos.

Se adiciona una pequea cantidad de tetrametil-pphenylendiamina al 1%, a un Oxidasa(+), se indica por un color prpura cultivo bacteriano colocado obscuro en el papel, en menos de 10 seg. Ej. sobre un papel filtro: Pseudomona aeruginosa Oxidasa (-), que consiste en una ausencia de color prpura. Ej. Escherichia coli

Se pretende comprobar la facultad de un moo de coagular el plasma por accin de la enzima coagulasa. La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible.

La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana). Nos permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos)

Se piensa que la toxicidad de Staphylococcus aureus es debida a la presencia de coagulasa, adems de las enterotoxinas que posee

PRUEBA DEL MANITOL

Sirve para detectar si las bacterias son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que cambiarn a color.

Sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

AGAR TSI
Medio diferencial, lactosa, sacarosa glucosa y produccin de gas y cido. Al sembrar una bacteria fermentadora de glucosa se producir un vire en todo el tubo pero al paso de mas de 16 horas incubacin regresara al color rojo debido a la degradacin aerobia de peptonas presentes en el medio Si la bacteria fermenta lactosa y/o sacarosa se producir un vire en todo el tubo el cual no podr ser neutralizado y se vera de color amarillo. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.

CITRATO DE SIMONS

Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato de sodio y fosfato de amonio como nica fuente de carbono y nitrgeno respectivamente; el medio tiene azul de bromotimol que cambia de verde a azul debido a la liberacin de iones amonio y eliminacin de citrato que generaran basificacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

MEDIO SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. FundamentoEl triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.