Controle Biolgico e Microbiolgico de Qualidade de Medicamentos (FFI 402)

CONTROLE MICROBIOLGICO DE PRODUTOS NO ESTREIS

Profas Yraima Cordeiro e Ana Luisa P. Miranda

Produtos no-estreis
Conceito:
Admite-se carga microbiana limitada; (cosmticos, formulaes de uso tpico e orais). Determinar a carga microbiana presente no produto; (qualitativo/quantitativo). Comprovar a ausncia de m.o patognicos e determinar o nmero de m.o viveis em funo do tipo de utilizao. Agentes infectantes oportunistas (m.o saprfitas); Cepas patognicas (proibitivos); Pessoas imunossuprimidas; Comprometer a estabilidade do produto, perda da eficcia teraputica.

Objetivos:

Fatores necessrios adequao dos nveis de m.o no produto terminado

Fatores diretos de contaminao: gua, matrias-primas e material de acondicionamento. Fatores indiretos: limpeza, instalaes inadequadas, pessoal no paramentado ou submetido a exames peridicos Fatores que contribuem para ou da carga microbiana: a) Frmula: ptn e carboidratos sacarose, sorbitol, propilenoglicol b) pH: Neutro ( m.o), cidos e alcalinos (m.o) b) Atividade da gua: incorporao de conservantes c) Processo: Temperatura elevadas

Padres microbianos em produtos no estreis

Primeiro insumo farmacutico com especificao relativa qualidade microbiolgica: gelatina, USP XII 1942 (104 bactrias totais por grama); Hoje: 103/g e ausncia de patgenos especficos em 10g (USP XVIII). Variaes em funo da origem da matria prima, uso final, via de administrao.
No Brasil: limite para levedura seca (2 Edio), 7,5 x 103 bct/g e 50 fungos/g Fitoterpicos: (Portaria 123, 1994) Especificao para matrias primas vegetais: < 105/g do total de viveis; < 104/g fungos; < 103/g enterobactrias; ausncia de Salmonella sp., S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e Aspergillus. Atualmente (outubro 2009): orientaes aplicveis a quaisquer formas farmacuticas; presena de mos totais e patognicos.

Para cosmticos, CTFA: seus padres so referncia internacional:

- Tolerncia de no mais que 500 UFC/g em produtos para bebs e para a rea dos olhos e < 103 UFC/g para todos os outros. E nenhum produto deve conter contedo microbiano nocivo para o usurio.

Produtos cosmticos
(ANVISA 1997, padro proposto Grupo de Microbiologia da Associao Brasileira de Cosmetologia)

Tipo I: produtos para uso infantil, para rea dos olhos, e para os que entram em contato com mucosa; Tipo II: demais produtos susceptveis contaminao. Tipo I: < 102 UFC/g de mo totais aerbios, ausncia de Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g(mL); ausncia de clostrdios sulfito-redutores tambm em 1g (talco); Tipo II: difere do acima no limite de aerbios, < 103 UFC/g.

Resoluo N 481, de 23 de setembro de 1999 (ANVISA)

Resoluo N 481, de 23 de setembro de 1999

REA DE APLICAO E FAIXA ETRIA PRODUTOS PARA USO INFANTIL PRODUTOS PARA REA DOS OLHOS PRODUTOS QUE ENTRAM EM CONTATO COM MUCOSAS
a.Contagem

LIMITES DE ACEITABILIDADE

TIPO I

de microorganismos mesfilos totais aerbios, no mais que 102 UFC/g ou ml Limite mximo: 5 x 102 UFC/g ou ml b.Ausncia de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausncia de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausncia de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausncia de Clostrdios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos).
a.Contagem

TIPO II

DEMAIS PRODUTOS COSMTICOS SUSCEPTVEIS A CONTAMINAO MICROBIOLGICA

de microorganismos mesfilos totais aerbios, no mais que 103 UFC/g ou ml; Limite mximo: 5 x 103 UFC/g ou ml b.Ausncia de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.Ausncia de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.Ausncia de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.Ausncia de Clostrdios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos).

Mtodos de anlise
Envolvem tanto os medicamentos no estreis quanto os cosmticos, abrangem trs etapas fundamentais:

1. Amostragem, englobando coleta; 2. Transporte e preparo da amostra para anlise;

3. Determinao numrica ou contagem das formas viveis.

1. Amostragem:
Deve ser representativa Critrios para obteno da amostra: Sacos e barricas (pulverizados) frao da parte superior, inferior e mediana. N ou N +1, N = no total recipientes Assepsia na rea prxima, vedao, lquidos Coleta e Transporte Temperatura adequada, material limpo, recipiente de boca larga (capacidade para 100g(mL). Quantidade a ser analisada 10g(ml) 1g(ml)

Preparo da amostra

Presena de conservante Ajuste do pH; Homogeneizao da amostra;

Inativao do conservante;

Sabonetes e supositrios (fragmentao e aquecimento).

2. Mtodos de Contagem Microbiana

Em meio slido, com semeadura da amostra em profundidade (pour plate); Em meio slido, com semeadura da amostra em superfcie; Membrana filtrante; Nmero mais provvel.

2. Mtodos de Contagem Microbiana

Meio slido com semeadura da amostragem em profundidade (pour plate) ou em superfcie (spread plate)
3-5 dias (30-35C, bactrias) 10 g (mL)
1 - 2 mL

gar casenasoja/gar nutriente gar Sabourauddextrose/gar batata 5-7 dias (20-25C, fungos)

1 - 2 mL

(Tampo fosfato ou NaClpeptona pH 7,2) 1:10

Limitao (Pour Plate): amostras q conferem opacidade ao meio, UFC/mL < 1 Limitao (Spread Plate): carga microbiana < 2 UFC/mL(g)

Mtodo spread plate harmonizado

Adicionar em duplicata 0,1 ml no TSA e SDA e espalhar nas superfcies dos meios prontos. Contar as placas com crescimento com menos 250 colnias para TAMC e menos que 50 colnias para TYMC.

Mtodo pour plate harmonizado

Adicionar 1 ml da diluio na placa (90 mm) e adicionar 15 a 20 ml de meio TSA e SDA em duplicata. Incubar TSA 30-35oC por 3 a 5 dias. Incubar SDA 20-25oC por 5 a 7 dias Contar as placas com crescimento com menos 250 colnias para TAMC e menos que 50 colnias para TYMC.

Membrana filtrante:
Alquotas (lquida), filtrao atravs de membranas. Depositadas nas placas 1. Filtrao (membrana nitrato ou acetato de celulose 0,45 m) 10mL ou 1g amostra (passagem membrana). Diluir se necessrio contagem entre 10 e 100 colnias. Lavar; 1 membrana (para cada meio) Bactrias Leveduras/Fungos n colnias desenvolvidas; Clculo UFC/g ou mL da amostra.
Permite avaliar volumes elevados, amostras contendo agentes antimicrobianos.

Mtodo harmonizado
Transferir quantidade validada para dois filtros. Lavar cada filtro com mtodo validado; Depositar um filtro em TSA e outro em SDA; Incubar TSA 30-35oC por 3 a 5 dias. Incubar SDA 20-25oC por 5 a 7 dias.

2. Mtodos de Contagem Microbiana

Incubao

Contagem das colnias

Clculos
TAMC TYMC

4/2

Contador / Lupa / Iluminao artificial/ Contador / Registrador

4/2 = 2 Fator de Diluio: 10 20UFC/mL

1/2 = 0,5 Fator de Diluio: 10 <10UFC/mL

Contagem
Spiral plate

Nmero mais Provvel

Estimativa fundamentada em probabilidade; Diluio seriada em tubos contendo meio de cultura e observao do crescimento.
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Inculo sem diluio

100 10-1
1ml

9ml

9ml

9ml

9ml

9ml

10-2
1ml

10-3

10-4
1ml

10-5
1ml 1ml 1ml

Diluio do ensaio Amostra inoculada Tubos com todos

Crescimento depois da incubao

Sem crescimento

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

Inculo sem diluio

100 10-1
1ml

9ml

9ml

9ml

9ml

9ml

10-2
1ml

10-3

10-4
1ml

10-5
1ml 1ml 1ml

+ + + 3

+ + + 3

+ + + [3 +

+ + 2

0]

Confrontar dados com tabelas estatsticas especficas

Impreciso maior que os outros mtodos; Permitir maior revitalizao dos mais debilitados; Prticas para amostras pouco solveis e translcidas; til quando se espera valores baixos de contagem.

Mtodo harmonizado, NMP

Preparar pelo menos 3 sries com 3 tubos. 3 alquotas de 1 g ou 1 ml so inoculados em 3 tubos com 9 a 10 ml de TSB. O mesmo para outras diluies. Incubar todos os tubos no mais do que 3 dias. Determinar o NMP na tabela (s TAMC).

Determinar a adequao do mtodo de contagem

Determinar se o mtodo permite a deteco de mos na presena do produto.

Usar <100 UFC do organismo a ser inoculado; Recuperao deve estar dentro de 50%;
TAMC = Total aerobic microbial count (no TSA, incluindo fungos) TYMC = Total combined yeast/mould count (no Sab.4%-Dextrose Agar, incl. bactrias)

Critrios de aceitao de qualidade microbiolgica para formulaes no estreis

Via de administrao TAMC UFC/g TYMC UFC/g 102 101 101 Organismos especificados: Ausncia em 1g ou mL E. coli E. coli S. aureus/ P. aeruginosa/ BG (-) bile-tolerante

Preparaes no aquosas 103 de uso oral Preparaes aquosas de uso oral Uso inalatrio (prep. Lquidas para nebulizao) 102 102

*BP 2008 harmonizado

Pesquisa de Patgenos Especficos

Antes da harmonizao
Principais patgenos pesquisados (devido a sua presena indesejada) nas formulaes farmacuticas. Pseudomonas aeruginosa (prep. tpicas, colrios, regies prximas aos olhos) Staphylococcus aureus (tpicos em geral) E. coli (orais) Salmonella sp (orais) Coliformes

Harmonizao Escherichia coli Salmonella spp Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Clostridium sp. Gram (-) bile-tolerantes Candida albicans

Testes de promoo de crescimento

Validao de meios de cultura; Utilizar cepas referncia de colees de culturas; Nveis de inculo < 100 UFC. Recuperao deve ser com um fator de 2 do controle (95% limite de confiana para NMP). Controle negativo (condies de esterilidade).

Procedimento Meios de Enriquecimento

Produtividade x Especificidade
Caldo lactose (Salmonella sp. e E. coli)

Incubao a 36 1oC de 24 a 48h. 10 g (mL)

100 mL

Diferenciao: microorganismo

identificao

do

Caldo casena-soja (S. aureus e P. aeruginosa).

Transferir alquotas dos meios de enriquecimento para meios de cultura de isolamento e diferenciao.

Meios de diferenciao
Meios de enriquecimento e seleo

Staphylococcus aureus (mtodo harmonizado, 2008):

Caldo casena-soja (TSB) 30-35oC, 18-24h Subculturas em gar Manitol (colnias amarelas, halo amarelo). 30-35oC, 18-72h
Confirmar por identificao.

Pseudomonas aeruginosa
(HARMONIZADO) TSB, 18-24h; Subculturas em gar Cetrimida colnias esverdeadas com fluorescncia (18-72h); Ensaio de oxidase; Confirmar por identificao.

Escherichia coli (HARMONIZADO):

Diluio do produto (1g ou 1mL) em TSB (30-35oC, 18-24h); Transferir 1,0mL do TSB para 100mL de Caldo MacConkey
(42-44oC, 24-48h);

Subcultivo em placa com gar MacConkey (30-35oC, 18-72h); Confirmar por identificao.

Fermentadores x no fermentadores de lactose

Salmonella sp
(HARMONIZADO):
Diluio do produto (10g ou 10mL) em TSB (30-35oC, 1824h); Transferir 0,1mL do TSB para 10mL de RVSEB (30-35oC, 1824h);

Subcultivo em meio gar xiloselisina-desoxicolato (XLD) (3035oC, 18-48h) - colnias vermelhas, ncleo negro. Confirmar por identificao.

Clostridium sp (HARMONIZADO):
Diluio do produto (1g ou 1mL) em TSB (20-25oC, 2-5h); Usar o volume de TSB correspondente a 1g do produto em 2 pores iguais; Aquecer 1 parte a 80oC por 10min; Transferir 10mL das alquotas para 2 frascos com meio reforado para Clostridia (crescimento em anaerobiose de 30 a 35oC, 48h); Subcultivo de cada tubo em gar Columbia (anaerobiose de 30 a
35oC, 48h); Teste da catalase ( catalase -), e s pode apresentar crescimento anaerbico.

Candida albicans (HARMONIZADO):

Inocular 10mL de uma diluio 1:10 do produto (1g ou 1mL) em 100mL SDB, (30-35oC, 3-5 dias); Subcultivo em placa SDA (30-35oC, 24-48h); Confirmar por identificao.

Provas adicionais
Capacidade de fermentao de diferentes acares; Aproveitamento de sais amoniacais como nica fonte de nitrognio; Uso do citrato como nica fonte de carbono (gar Citrato); Formao de acetona (reao de Voges-Proskauer); Reao da peroxidase, coagulase, etc; Deteco de micoplasma, micotoxinas.

Uso de mtodos automatizados e miniaturizados para identificao.

gua na Indstria
Limites de alerta e de ao. Padres microbianos: os nveis de carga microbiana para gua de uso industrial (bulk) inexistem, exceto ao se referir gua estril. Situao contornada por cada empresa pela adoo do seu prprio padro interno. Potabilidade: legislaes e pr-requisitos variados nos diversos pases.

FEuropeia limite de ao para AP (100mos/100mL) e ApI (10mos/100mL) USP, gua bulk ou acondicionada como produto.

gua na Indstria

Tipos de gua, RDC 17, 2010.

gua Purificada limite de ao 100UFC/mL gua Purificada Estril gua purificada esterilizada em embalagem apropriada. gua Estril para Injeo gua para injeo acondicionada e esterilizada. Diluente para produtos parenterais; gua Estril para Irrigao ~AEI, especificao no inclui material particulado; gua Estril para Inalao gua para injeo esterilizada em embalagem apropriada. Cumpre com os requisitos da APE, exceto quanto ao pH, que deve estar entre 4,5 e 7,5. gua Bacteriosttica para Injeo reconstituio de injetveis de dose mltipla a partir do mesmo frasco. gua para injeo (bulk).

Anlise da gua
Potabilidade caracterstica depende da legislao de cada pas. Principais indicadores de contaminao fecal: Coliformes totais: bacilos Gram (-) no esporulados, aerbios ou anaerbios facultativos, fermentam a lactose a 35 37oC de 24 a 48h com produo de gs. Espcies dos gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella (obs. Enterobacter se multiplica no ambiente livre). Coliformes fecais ou termotolerantes: fermentam lactose a 44,5 0,2oC 24h. Seguramente somente a Escherichia coli.

ICFs: mos presentes nas fezes em quantidade >> q patognicos.

Estreptococos fecais: origem da contaminao, predomina nas fezes de animais; distncia da fonte de contaminao;

Clostridium perfringens: esporulado, indicador de contaminao

fecal muito remota;

Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, C. albicans: indicativos

de tratamento no eficiente, pequeno tempo de sobrevida, presena associada condio de higiene.

Padres microbianos

MS, Portaria 36, 19/01/1990 MS, Portaria 518, 25/03/2004

gua potvel: ausncia de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL; gua na sada de tratamento: ausncia de coliformes totais em 100mL; Reservatrios e rede de distribuio: ausncia de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL. Quando cianobactrias > 20.000cls/mL: anlise semanal de cianotoxinas na gua na sada do tratamento, na entrada de clnicas de hemodilise e indstrias de injetveis; Recomenda-se avaliar heterotrficos indicativos das condies de higiene.

Anlise bacteriolgica da gua: determinao quantitativa

Coleta frasco estril, desprezar a 1 amostra, e mant-la a 10oC se no analisar de imediato. Para amostras cloradas, adicionar tiossulfato de sdio (0,1mL de soluo a 10% para 100mL de gua).

Contagem de viveis totais valor absoluto sem significado, controle somente sobre variao esperada, ndice das condies de higiene.

Identificao de coliformes totais e fecais:

Teste presuntivo: deteco de microorganismos que fermentem a lactose. Uso de caldos Lactose ou Lactose-SDS em tubos de Durham invertidos. Formao de gs, resultado + Membrana filtrante (meio Endo), colnias escuras, brilho metlico +.

Teste confirmatrio: h mos que no os coliformes que podem fermentar a lactose como bacilos Gram (+) esporulados e leveduras. Transferir amostras dos tubos + para tubos contendo meio seletivo Caldo Bile-Verde Brilhante que contm corante que impede proliferao de formas esporuladas e leveduras e componente que favorece proliferao de coliformes. O resultado tambm a produo de gs a partir da fermentao da lactose.

Escherichia coli: caldo EC (lactose, proteases e sais biliares) Incubao a 44,5oC.

Em todas as etapas a contagem realizada pela tcnica de NMP, considerando a resposta positiva a fermentao da lactose.

Controle da gua na indstria

Mtodos alternativos Custo x benefcio

Contagem direta de clulas marcadas com fluorforos: colorao com marcadores fluorescentes (para cidos nucleicos). Nvel deteco mo (viveis x no viveis), 2h. ATP, luciferina, luciferase: deteco de qualquer tipo de microorganismo (limitao <102-103 UFC) (MicroCountTM digital, pr
incubao 24h.)

Automao e mtodos alternativos para enumerao microbiana

Contadores em espiral ( tempo e material) (4 x 102 a 4 x 105 UFC); AutoPlate 4000 (Spiral Biotech, USA) e ProtoCOL (Symbiosis, UK); Petrifilm e SimPlate, subtituio do crescimento tradicional em placa com gar slido; Bioluminescncia; Epifluorescncia direta (DAPI ou alaranjado de acridina); Impedncia: resistncia ao fluxo de uma corrente alternada, que passa atravs de material condutor. Equipamentos disponveis no mercado:
Bactometer (BioMerieux) e Malthus AT automatizados e avaliam > 100 amostras simultaneamente. Anlise de quantidades grandes de amostra (de 10 a 100mL), sensibilidade.

Mtodos rpidos para identificao microbiana

Sistemas miniaturizados e automatizados (exs. API e Vitek, BioMerieux Inc.). Identificao genotpica: PCR, eletroforese de fragmentos de DNA. Cromatografia gasosa (Hewllet Packard) esterificao de cidos graxos produzidos pelo metabolismo de mos. Identificao de cepas microbianas a partir de metablitos especficos. Mtodos imunolgicos.

BD BBL Crystal - Sistema de Identificao de Microorganismos Clinicamente Relevantes