ESCUELA NORMAL MIXTA PCIA.

DE SAN LUS FORMACIN PROFESIONAL PARA AYUDANTES DE LABORATORIO NOMBRE: COMISIN:

TERICO-PRCTICO N 5: MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS INTRODUCCIN Una tcnica esencial en Microbiologa es la de obtencin de cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento. SIEMBRA Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicacin, si se incuba en condiciones adecuadas. Para ello una pequea porcin de cultivo o muestra, que se denomina inculo se transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introduccin de otros microorganismos ajenos al inculo. El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como tcnica asptica. La toma del inculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente: hablar. Coloque frente a usted el mechero y la preparacin o muestra que contiene los microorganismos, as como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos. Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero. El ansa de siembra se esteriliza por flameado directo (flamelo hasta que alcance La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin

un color rojo incandescente) y antes de retirar el inculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar la muerte de los microorganismos a sembrar (enfrelo en la proximidad de la llama unos 10 a 15 segundos). Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa a la llama del mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.

Introduccin a la Microbiologa

Nunca debe depositarse un tapn sobre la mesada o gradilla, pues estos Cuando est destapado, mantener el tubo en la forma ms horizontal posible para Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde

elementos estn cargados de microorganismos. evitar que los microorganismos del ambiente, en su cada, tengan acceso al interior. sern transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el ansa sea introducida. Tambin se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo as el riesgo de contaminacin. Para retirar el inculo o sembrar medios de cultivos en placas de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llvela a la proximidad de la llama del mechero y tome el inculo con el ansa de siembra. Otro mtodo permitido consiste en retirar el inculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introduccin del ansa, para evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio. Si la siembra se realiza con pipeta, sta debe estar convenientemente preparada y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta introducindola en una solucin antisptica (hipoclorito de sodio al 5%). Transfiera el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.). La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efecta con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioqumicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. TOMA DEL INCULO Si la muestra proviene de un medio lquido, el inculo se toma agitando suavemente el ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extremo del filamento del ansa de siembra. Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa de Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de

Introduccin a la Microbiologa

flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el soporte necesario. TRANSFERENCIA La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Para trasladar los microorganismos de un medio de cultivo a otro, utilizamos el ansa de siembra. Esta ansa consta de un filamento de platino, que puede ser recto o terminado en anillo. Para facilitar el manejo, este filamento est sujeto a un mango aislante.

a) b)
a) ansa en anillo b) ansa en punta Antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismos tenemos que esterilizarla a la llama del mechero hasta que todo el filamento quede incandescente. Dejamos enfriar cerca de la llama y luego podemos introducirla en el recipiente que contenga el cultivo o la muestra que queremos trasladar. Se pueden presentar los siguientes casos: Siembra en tubos sobre medios slidos a) Siembra en picadura o puncin Se introduce el ansa en punta con el inculo en un tubo conteniendo agar en columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma paralela asegurndose que el inculo quede distribuido a lo largo de toda la puncin. Esta tcnica nos permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxgeno y su movilidad. b) Siembra en estras Se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra en estras en un tubo que contiene agar pico de flauta o agar inclinado.

Introduccin a la Microbiologa

Siembra en superficie sobre medios slidos a) Siembra en agotamiento por estras Con el ansa cargada de material hacemos una serie de estras paralelas no superpuestas sobre una tercera parte de la superficie de la placa de medio de cultivo. Esterilizamos el ansa y hacemos una serie de estras en direccin perpendicular a la anterior, comenzamos donde esta termina. Este procedimiento se repite varias veces. El flameado del ansa disminuye la cantidad de microorganismos que extendemos en la misma, de forma que una vez inoculadas las placas en estufa durante 24 48 hs a la temperatura adecuada, obtendremos colonias aisladas en las ltimas estras, separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la obtencin de cultivos puros mediante resiembra.

b) Siembra con esptula de Drigalsky Se pipetea un volumen de inculo y se deposita sobre la superficie de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una esptula de Drigalsky estril (previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada) se disemina la muestra por toda la superficie, efectuando movimientos de rotacin hasta su completa absorcin.

Introduccin a la Microbiologa

Esta tcnica permite sembrar inculos sobre superficies grandes, para obtener un crecimiento confluente que nos permite estudiar en efecto de antimicrobianos y el recuento de colonias.

c) Siembra con hisopo Se embebe un hisopo de algodn estril en un tubo que contiene un cultivo lquido previamente homogeneizado. Se elimina el exceso de inculo presionando el hisopo contra las paredes internas del tubo. Se disemina el inculo por toda la superficie de la placa con el medio slido; para ello se estra toda la placa en una direccin (teniendo la precaucin de alcanzar bien los bordes de la placa) partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90 y se estra nuevamente toda la superficie, finalmente se gira 45 y se vuelve a estriar. Esta tcnica permite sembrar inculos abundantes sobre superficies grandes a los fines de obtener un crecimiento confluente que nos permita estudiar el efecto de los antimicrobianos.

d) Siembra en placa vertida Se lleva un volumen de inculo a un tubo que contiene agar fundido y templado (45C), se homogeiniza y se vierte el contenido en una placa de Petri estril, se agita la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir sus contenidos y se deja solidificar.
5

Introduccin a la Microbiologa

Una vez incubada a temperatura adecuada, observamos colonias en profundidad (inmersas en el medio) y en la superficie.

Descripcin de las colonias Si se toma un ansa cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estras de sta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya diluyendo sobre la superficie llegar un momento en que las bacterias depositadas en la estra estn bien separadas unas de otras, reproducindose cada una en progresin geomtrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generacin, que vara segn la especie bacteriana, despus de cierto tiempo, cada una se habr multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeo promontorio constituido por clulas bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color, consistencia, etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada est constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola clula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas, fisiolgicas, etc., de una bacteria, se necesita que sta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en placa de Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza despus de la incubacin apropiada, mediante observacin al microscopio. La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. La terminologa mencionada a continuacin sobre algunas de las caractersticas ms constantes de una colonia bacteriana es muy til:

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAO: Estimar el dimetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.

Introduccin a la Microbiologa

ELEVACIN: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada, etc. BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc. COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser OPACIDAD: Transparente, opaca, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el ansa

de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.

bacteriolgica para determinar la consistencia.

Introduccin a la Microbiologa

NOMBRE:

COMISIN:

PARTE PRCTICA: MTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO SE MICROORGANISMOS Objetivos Ejecutar las tcnicas bsicas para la manipulacin de cultivos microbianos en forma asptica. Adquirir conocimientos bsicos, tericos y prcticos, de la siembra y aislamiento de bacterias. Adquisicin de criterio en la eleccin de los distintos medios de cultivo. Actividades a desarrollar (I) Ejercitacin de las diversas tcnicas de siembra de los microorganismos. Se utilizarn los siguientes medios de cultivo Agar Nutritivo Agar Chapman Agar Levine EMB

1) Siembra de placas de Petri por agotamiento por estras en diferentes medios de cultivo: se toma el material con el ansa estril y se siembra por diseminacin en estras por agotamiento con la finalidad de aislar microorganismos. Tcnica a. Con el marcador dividir la placa de Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la inoculacin, se tenga como se indica en la figura:

b. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocndola sobre el mesn. Con el ansa en anillo previamente esterilizada tomar una ansada de cultivo bacteriano. c. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en la gradilla.

Introduccin a la Microbiologa

d. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la placa. e. Esterilizar el ansa flamendola y mientras que se enfra, girar la placa 90 hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha. f. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estras no deben tocar el sector 1. De esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras. g. Esterilizar de nuevo el ansa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estar a la izquierda y el 3 a la derecha. h. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo:

i. j.

Incubar a 37C por 24-48 horas. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias. ( nota: En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 s).

k. Anotar las caractersticas de las colonias aisladas. l. Preparar un frotis, teir con la tcnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersin para confirmar su pureza. 2) Siembra en placa de Petri con esptula de Drigalsky : con pipeta estril colocar 0,1 ml de cultivo en medio lquido sobre el medio slido, diseminar inmediatamente con esptula. 3) Siembra en placa de Petri con hisopo estril : se embebe el hisopo sumergindolo en un medio lquido y se disemina en estras. 4) Siembra en placa por mtodo de placa vertida : se coloca 1 ml de cultivo en medio lquido sobre una placa de Petri vaca estril e inmediatamente se vierte agar fundido y templado a 45C, se agita la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir sus contenidos y se deja solidificar.

Introduccin a la Microbiologa

5) Siembra en agar inclinado: se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra en estras. a. Agitar el cultivo lquido para resuspender los microorganismos en el medio. Evitar mojar la tapa del tubo con el cultivo. b. Esterilizar el ansa a la llama. c. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocndola sobre el mesn. d. Insertar el ansa estril en el cultivo y tomar una ansada llena para transferirla al otro tubo que contiene el medio de cultivo slido estril. e. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo lquido, tapar y colocar en la gradilla. f. Destapar el tubo que contiene agar nutritivo estril y flamear su punta. No dejar que la tapa se contamine colocndola sobre el mesn. g. Para inocular el medio slido estril introducir el ansa que contiene el cultivo en el tubo de agar nutritivo estril hasta el fondo del tubo donde comienza el bisel y diseminar el inculo sobre la superficie del mismo moviendo de lado a lado y hacia arriba hasta llegar a la punta del bisel. h. Flamear nuevamente la punta del tubo y tapar. i. j. Esterilizar nuevamente el ansa. Colocar los tubos en su gradilla e incubarlos a 37C por 24 horas.

6) Siembra en agar en columna: por picadura con ansa en punta. 7) Siembra en agar pico de flauta: se toma el material con ansa recta o en anillo y se siembra por picadura y en estras. (II) Observar y registrar las caractersticas de desarrollo en cada uno de los medios. (III) Observar y registrar las caractersticas morfolgicas de las colonias de los distintos microorganismos.

10