Preparaciones microbiolgicas y tinciones Domnguez Martnez Ricardo Ordua Amado Giuliana Carolina Equipo 8

Resumen Se observaron diversas bacterias en un microscopio de campo claro mediante preparaciones hmedas y fijas, tinciones como la simple, las diferenciales como lo son las de Gram y Ziehl Neelsen que son para teir bacterias acido-alcohol resistente; y por ultimo tinciones selectivas tales como endoespora y negativa (cpsula). Logrndose apreciar las diferencias morfolgicas entre las bacterias. Por lo tanto, dependiendo del microorganismo que se tenga, se debe utilizar la tincin apropiada para observarlo. Resultados Preparacin Hmeda: Observamos a los protozoarios que son translucidos en forma circular u ovalada en su ambiente natural y como se dificulta verlos debido a que andan en constante movimiento. Se pueden diferenciar fcilmente de las bacterias debido a que son 10 veces ms grandes en promedio que estas. Tincin simple Saccharomyces cerevisiae: De color azul (por el colorante que aplicamos), y estaba en forma de dos circunferencias juntas. Rhodotorula sp. : Varios microorganismos circulares dispersos. Serratia marcescens: Generalmente podemos observar bacilos de tamao muy pequeo, su agrupacin es en pares y triadas, coloreadas de color rosa. Maraxella sp. : Cocos, agrupados en parejas (diplococos) se encuentran teidos color rosa por lo tanto su Gram es positivo Tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) Mycobacterium sp. : Es un bacilo no tiene agrupacin alguna, presenta una coloracin roja ya que es un microorganismo el cual tiene una cidoalcohol resistencia (BAAR). Tincin Gram positiva Micrococcus leutus: Al teirse de azul es bacteria Gram positiva con morfologa en cocos ttradas. Streptomyces sp. : Se tie de color azul, se ven las bacterias largas y amontonadas entre s por lo tanto son filamentosas. Bacillus cereus: Se observan bacilos de color azul, principalmente tienen una agrupacin en duplas o en cadenas de ms de 4 bacilos juntos. Tincin Gram negativa

Mycobacterium sp. y Micrococcus leutus: Observan claramente los dos microorganismo ya que Mycobacterium sp. al ser BAAR se tie de rojo y M. leutus es una bacteria Gram positiva azul en forma de cocos Tincin selectiva (Endospora) Bacillus cereus: Bacilos de color rosado, en el centro en los extremos del bacilo se puede observar la endoespora coloreada de color verde, principalmente tienen una agrupacin en duplas o en cadenas de ms de 4 bacilos. Tincin Negativa (cpsula) Muestra pulque: se observ un bacilo sin agrupacin, con la capsula color morado ya que es la que se resalta por el color primario que le agregamos en este casi cristal violeta, a su alrededor se observa un halo. Anlisis En la preparacin hmeda se observan los microorganismos movindose. Con una pipeta Pasteur se coloca una gota de la muestra en el centro del portaobjetos y luego sta se cubre con un cubreobjetos para as poder verlo en el microscopio. No debe pasar mucho tiempo pues la preparacin se seca. Las preparaciones fijas se hacen para poder teir los microorganismos posteriormente. En condiciones aspticas y con el asa estril, se toma una pequea cantidad de cultivo y se pone en el centro del portaobjetos (si el cultivo tomado es slido se debe mezclar con una gota de

agua en el portaobjetos). Se deja secar y despus, para fijar, se pasa 3 veces por la flama del mechero. Las tinciones pueden ser: -SIMPLES. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno. - DIFERENCIALES. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica. Realizamos 2 tinciones de este tipo: 1) tincin de Gram: Primero se agreg un colorante con carga positiva (cristal violeta) que se enlaza a carga negativa de partes internas de los microorganismos, observndose totalmente teidos. Posteriormente se aade lugol, que acta como agente mordente (I/KI) y forma un complejo con el cristal violeta( refuerza la unin entre el colorante y el sustrato).Despus se aade un agente decolorante (alcohol/acetona), siendo ste el punto crtico de la tincin: si las bacterias son Gram positivas no se decoloran debido a que tienen una pared gruesa de peptidoglucano que slo se deshidrata, impidiendo la salida del complejo; si las bacterias son Gram negativas se decoloran porque tienen una capa lipdica y lipopolisacridos que se eliminan con el solvente no polar, por lo que el complejo puede salir de la clula. Finalmente se aade un colorante de contraste (safranina) que tie a las bacterias Gram negativas que estaban incoloras. 2) Tincin de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen).

El colorante primario es fuscina fenicada. Si las clulas son cido alcohol resistentes (contienen cidos miclicos) no permitirn el paso del colorante, por lo que se calienta la muestra para reblandecer las ceras y as, permitir el paso del colorante. Las bacterias que son no cido alcohol resistente tambin se tien con el colorante. Posteriormente se aade un agente decolorante (alcohol cido) que arrastrar el colorante fuera de las bacterias no cido alcohol resistentes(carecen de los cidos miclicos en su pared celular). En cambio, en las bacterias cido alcohol resistente, la fuscina fenicada, que es no polar, es muy soluble en los lpidos de su membrana, por lo que se quedarn teidas. Las bacterias no cido-alcohol resistentes tomarn el color del colorante de contraste. - SELECTIVAS. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica. Realizamos 2 tinciones de este tipo: 1) Tincin Selectiva (endospora) Las endosporas son refrctiles, por lo que pueden observarse haciendo una tincin simple, sin embargo no todas las estructuras refrctiles son endosporas, por ello se lleva a cabo la tincin selectiva. En esta tincin el colorante primario es el verde de malaquita, que servir para teir la endospora, pero est es impermeable al colorante pues contiene dipicolinato de calcio, por lo que debe calentarse.

Finalmente se agrega safranina para resaltar a la clula vegetativa. 2) Tincin Negativa (cpsula) La cpsula est constituida principalmente por agua y polisacridos como dextranas y alginato. Por su composicin qumica no es fcil teirla, por lo que se tiene que oscurecer el fondo de la preparacin para observarla y se utiliza un colorante para teir a las clulas. El fondo se oscurece con tinta china, la cual es un coloide por lo que no penetra las clulas y posteriormente se agrega safranina para poder visualizar las bacterias. La cpsula se observa como una zona transparente alrededor de la clula. Conclusiones Es importante conocer las diferentes caractersticas morfolgicas de los microorganismos, as como la composicin qumica de las estructuras que los conforman para saber el tipo de tincin que se debe realizar. De igual forma, es importante saber realizar adecuadamente las tcnicas de preparacin y tincin para tener xito en la observacin al microscopio de los microorganismos. Bibliografa Montoya V. Hugo H. Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines. 2da edicin, editorial Universidad de Antioquia, Colombia 2008. pp. 20