MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

ndice

Introduccin 1 Introduccin 2 La produccin de vino como modelo de un proceso de fermentacin industrial

o o o o o o o o o o o o o o o o

Presentacin Hongos y las levaduras Crecimiento de microorganismos Factores ambientales que afectan al crecimiento: temperatura T R Actividad de agua pH Potencial redox y concentracin de oxgeno Radiacin Presin hidrosttica Control de microorganismos Metabolismo microbiano: introduccin Catabolismo de la glucosa Respiracin y fermentacin Expresin de la informacin gentica

Tratamiento de Residuos slidos urbanos Tratamiento de aguas residuales

Introduccin a la Microbiologa Ambiental

1.- Introduccin. A la hora de desarrollar un proceso industrial destinado a la produccin de un metabolito secundario o de una enzima de origen microbiano, hay que considerar varios aspectos: (1) el aislamiento del microorganismos de inters, la deteccin de los metabolitos secundarios deseados y la conservacin del microorganismo aislado para la produccin industrial estable, (2) el diseo del proceso de fermentacin, y (3) la mejora de las cepas aisladas para incrementar el rendimiento. Todos los organismos producen metabolitos primarios (aquellos que intervienen en las rutas centrales del metabolismo y que son esenciales para la supervivencia y, en general, idnticos en todo tipo de organismos) y secundarios. Estos ltimos son especficos de cada tipo de organismo y estn involucrados en el establecimiento de las relaciones ecolgicas del organismo productor. 2.- Aislamiento y manipulacin de cultivos de inters. 2.1.- Aislamiento de cultivos El primer paso en el proceso industrial es el aislamiento de un microorganismo que produzca un metabolito secundario con inters industrial. La tarea de aislamiento de microorganismos hay que plantearla considerando las caractersticas del producto y del proceso que se va a realizar y las caractersticas ecolgicas de la muestra que se toma. Lo primero nos indicar dnde tomar las muestras y lo segundo cmo disear los medios de aislamiento para los microorganismos presentes en dichas muestras. El estudio ecolgico de las caractersticas del microorganismo de inters permitir hacer una bsqueda sistemtica en los diferentes nichos de un ecosistema, lo que proporcionar un gran nmero de microorganismos de salida para el proceso de deteccin. Un esquema de estudio ecolgico previo a la toma de muestras comprendera los siguientes pasos: (1) lista de grupos de microorganismos que van a ser aislados (los medios y tcnicas de cultivo son diferentes para bacterias y hongos, por ejemplo); (2) descripcin del ecosistema o hbitat en el que se van a tomar las muestras, (3) agrupacin de las muestras segn el material de origen (suelo y horizontes del suelo, agua, material vegetal, etc.); (4) lista de los parmetros ambientales a considerar (pH, salinidad, potencial redox, temperatura, etc.); (5) lista de los substratos naturales disponibles por los microorganismos autctonos en su ambiente natural, (6) diseo de las tcnicas de aislamiento usando la informacin de los puntos anteriores, (7) evaluacin de las tcnicas de aislamiento usando patrones internos como control, y (9) utilizacin de procedimientos de enriquecimiento para los microorganismos que puedan ser de inters. 1.2.- Deteccin de metabolitos secundarios:

Una vez recogidas las muestras hay que desarrollar el procedimiento de bsqueda y deteccin (screening en ingls) del metabolito secundario de inters. Histricamente la bsqueda se ha dirigido hacia la produccin de antibiticos; pero actualmente se ha ampliado el campo a otros productos teraputicos y, en general, puede desarrollarse cualquier bsqueda para la que se disponga de un sistema de deteccin suficientemente correcto. En cualquier caso, haz que considerar dos cualidades importantes a la hora de disear un proceso de deteccin: (1) la selectividad: se ha de poder detectar un compuesto de inters mezclado con un nmero muy elevado de compuestos que no son interesantes; y, (2), la sensibilidad: la concentracin del metabolito secundario de inters puede ser extremadamente baja. La bsqueda puede hacerse en cultivos slidos o en cultivos lquidos. Sin embargo, puesto que la produccin ha de realizarse en cultivos lquidos y puesto que los metabolitos secundarios de cultivos slidos son diferentes de los de cultivos lquidos, es conveniente realizar la deteccin, siempre que sea posible, en medios de cultivo lquido. Las pruebas de actividad se pueden realzar sobre diferentes tipos de organismos (animales vivos, plantas, bacterias, hongos), sobre cultivos celulares o sobre preparaciones subcelulares. Para cada tipo de bsqueda hay que disear un procedimiento de deteccin adecuado. 1.3.- Desarrollo del inculo: Tanto en la primera produccin industrial como en las siguientes es necesario utilizar grandes volmenes de cultivo por lo que la preparacin de un inculo adecuado es una tarea de importancia capital. En un proceso industrial puede ser necesario realizar incubaciones de gran volumen (>160.000 litros) para las que son necesarios tambin grandes inculos (>1.000 litros). Para repetir rutinariamente la operacin de produccin es necesario utilizar cultivos almacenados del microorganismo de inters (cultivos stock) y a partir de ellos hay que desarrollar el inculo intentando: (1) minimizar la prdida de viabilidad durante el proceso de recuperacin del microorganismo, (2) obtener una copia genticamente idntica a la que se haba almacenado (esto es: evitar mutaciones y contaminaciones), (3) incrementar la biomasa del cultivo y (4) cultivar el microorganismo hasta un estado fisiolgico adecuado para lograr la mayor eficiencia en la fase final de produccin. Al desarrollar un inculo es necesario conseguir una alta velocidad de crecimiento y de concentracin de biomasa al inicio del proceso de fermentacin. 1.4.- Mejora de las tcnicas de cultivo: Desde las primeras etapas del desarrollo de un proceso industriales hace necesario mejorar el medio de cultivo del microorganismo para conseguir un mayor rendimiento en la produccin del metabolito de inters, reducir la presencia de otros productos que puedan dificultar el aislamiento del compuesto deseado y reducir los costes de produccin. Puesto que el nmero de variables qumicas y fsicas independientes que afectan el crecimiento del microorganismo es muy alto, su optimizacin mediante el anlisis sistemtico de cada una de ellas se hace rpidamente

imposible. Para realizar el estudio cuando hay ms de cinco variables independientes se recomienda utilizar una aproximacin de anlisis multivariable (mtodo de Packett-Burman) que consiste en agrupar varias variables para decidir sobre el incremento en rendimiento debido al cambio de un grupo de ellas. 1.5.- Conservacin de los microorganismos importantes: La conservacin de microorganismo de inters industrial es una tcnica bsica en todo el proceso. La conservacin ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente productivas durante largos periodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotpicos, especialmente en las caractersticas relacionadas con la produccin de los metabolitos secundarios de inters. Se han desarrollado varias tcnicas de conservacin; (1) el subcultivo de clulas activas, (2) la desecacin de cultivos, (3) la liofilizacin, (4) la congelacin mecnica (-20 -80C) y (5) la ultracongelacin en vapor de nitrgeno lquido (-156C) o en nitrgeno lquido (-196C). Generalmente, las tasas de supervivencia son ms elevadas despus de la conservacin en nitrgeno lquido que tras cualquiera de los otros mtodos. En los casos de conservacin por congelacin, es necesario aadir a los cultivos agentes crioprotectores (glicerol, Di-MetilSulfOxido, DMSO).

MICROBIOLOGA APLICADA
1.- Introduccin La Microbiologa Industrial trata de utilizar microorganismos para que produzcan compuestos o realicen funciones que sean tiles desde un punto de vista aplicado. Comprende el cultivo de microorganismos para su propia produccin como alimento y para la produccin y transformacin de frmacos, alimentos, disolventes orgnicos, etc. Para poder utilizar microorganismos en procesos aplicados debemos conocer los principios bsicos del funcionamiento celular y del cultivo controlado de microorganismos. Para cada producto o transformacin concreta ser necesario, adems, determinar qu microorganismo es el ms adecuado para llevarlo a cabo. En este captulo revisaremos algunos aspectos bsicos para el estudio de los procesos de produccin que estudiaremos en captulos siguientes. 2.- Tipos de organizacin celular Los seres vivos pueden agruparse en tres grandes grupos que se separaron en pocas evolutivas muy antiguas: bacterias, arqueas y eucarias. Bacterias y arqueas presentan un tipo de organizacin celular conocida como procaritica porque en ellas el material gentico no est separado del resto del citoplasma por una membrana nuclear (son clulas sin ncleo), mientras que los organismos pertenecientes al grupo de eucaria presentan un ncleo diferenciado del resto de la clula y, por tanto, su organizacin celular se denomina eucaritica. La teora evolutiva establece que todos los seres vivos (procariticos y eucariticos) derivan de un antepasado comn cuyos descendientes fueron divergiendo a lo largo de la evolucin. Mediante tcnicas de biologa molecular ha sido posible ir estableciendo las relaciones familiares entre los diferentes grupos de organismos de forma que pueden representarse en esquemas que relacionan los grupos entre s. Estos esquemas se conocen generalmente con el nombre de rboles universales de la vida. Los organismos ms relevantes desde el punto de vista industrial y aplicado pertenecen al grupo de bacterias y eucarias. Dentro de las bacterias se encuentran la mayora de los organismos patgenos, un gran nmero de productores de substancias de inters aplicado (antibiticos, por ejemplo) y productores y agentes alterantes de alimentos. Dentro de los eucarias nos encontramos los animales, plantas y hongos (las levaduras unicelulares y los hongos filamentosos). Hay algunas arqueas que participan en procesos de inters aplicado (organismos metangenos, por ejemplo). Aunque su nmero es reducido, probablemente se ir incrementando en el futuro conforme se profundice en el estudio de este tipo de microorganismos.

En esta presentacin hemos dejado de un lado los virus por ser estructuras acelulares que slo desarrollan actividad biolgica cuando se encuentran en el interior de una clula a la que infectan y por su escasa relevancia en microbiologa industrial (dejando a un lado su efecto negativo sobre ciertos cultivos industriales). El estudio de la organizacin interna de las clulas procariticas y eucariticas cae fuera de las posibilidades de este documento y los conceptos bsicos deben ser repasados por los alumnos. 3.- Estructura de la pared celular La estructura de la pared celular de las bacterias permite distinguir dos grandes grupos: las bacterias Grampositivas (cuya pared celular contiene una sola membrana, una gruesa capa de peptidoglicano y cidos teicoicos, Fig. 1A) y las bacterias Gram-negativas (cuya pared celular tiene dos membranas ligeramente diferentes que delimitan un espacio periplsmico en el que se encuentra una delgada capa de peptidoglicano, y que presentan lipopolisacridos en el exterior, Fig. 1B)

Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de bacterias Grampositivas y Gram-negativas son responsables de diferente sensibilidad a antibiticos y de diferencias en su capacidad de exportar protenas al exterior de la clula. Las bacterias entricas son ejemplos de Gram-negativas mientras que las bacterias lcticas son ejemplos de Gram-positivas

Las clulas eucariticas pueden tener pared que recubra su membrana. Esto ocurre en los hongos y en las plantas. Sin embargo, la estructura de esta pared es diferente a la de las bacterias. Una diferencia esencial es que los eucariontes no tienen peptidoglicano en su pared celular. Las enzimas que sintetizan el peptidoglicano son dianas especficas para antibiticos activos frente a bacterias pero son inactivos frente a eucarias (por ejemplo, las penicilinas y cefalosporinas). 4.- Membranas biolgicas Las membranas biolgicas son unas estructuras esenciales para el mantenimiento de la integridad celular y para el correcto funcionamiento de los procesos biolgicos. Desempean dos funciones esenciales: (1) son barreras de permeabilidad que separan diferentes compartimentos celulares, y (2) son un soporte que permite mantener ordenados los componentes celulares para que puedan funcionar correctamente.

Las membranas biolgicas son impermeables al agua, compuestos polares y compuestos cargados. Para que este tipo de compuestos entre o salga de la clula o de los compartimentos intracelulares son necesarios canales de paso especficos. Las molculas apolares, sin embargo, s pueden atravesar las membranas biolgicas. Las barreras de permeabilidad permiten mantener concentraciones diferentes de iones o molculas a ambos lados de una membrana biolgica. Esta diferencia de concentraciones (que se suele denominar gradiente de concentracin) da lugar a la existencia de una energa potencial que puede ser transformada en la energa qumica necesaria para el funcionamiento de los procesos biolgicos. Por tanto, los agentes qumicos que destruyen las membranas biolgicas son letales para las clulas ya que destruyen los gradientes que son la base de muchos procesos biolgicos y desordenan los componentes celulares al destruir el soporte en el que se encuentran.

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL III El Vino 1.- Introduccin En este captulo vamos a utilizar la produccin de vino como esquema para estudiar los principios bsicos de la microbiologa industrial y de la biologa de microorganismos. Ms adelante estudiaremos otros procesos de produccin industrial con un mayor detalle. La microbiologa industrial est dedicada a la utilizacin comercial de microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia econmica, ambiental y social. Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentacin en microbiologa industrial para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propsitos industriales. Sin embargo, no hay que confundir esta utilizacin del trmico con el proceso bioqumico de fermentacin consistente en la regeneracin del poder reductor (NADH) por un procedimiento no oxidativo (estos procesos se estudiarn ms adelante en el curso). La fermentacin que tiene lugar en la produccin del vino, en este sentido, comprende ambos significados: por un lado, se trata bioqumicamente de un proceso de fermentacin (produccin de alcohol a partir de glucosa en condiciones anaerobias) y es una fermentacin industrial en el sentido de que se trata de un proceso industrial llevado a cabo por microorganismos. El desarrollo de una fermentacin industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus nombres en ingls, procesos upstream y procesos downstream. Los procesos upstream comprenden la seleccin y preparacin del microorganismo, la preparacin del medio de cultivo y de las condiciones de fermentacin (cultivo). Los procesos downstream incluyen la purificacin del producto y el tratamiento de los residuos de la fermentacin. En el proceso de fermentacin del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los procesos upstream de la seleccin y preparacin de cepas de levadura, tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de fermentacin. Los procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificacin y el de los residuos del proceso. Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso modo en dos clases:

(1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los productos alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos qumicos producidos por fermentacin) y (2) los productos de bajo volumen y alto valor (los frmacos, por ejemplo).

Por otro lado, hay que sealar que tienen origen en fermentaciones industriales un gran nmero de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

(1) alimentos (derivados lcteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino, cerveza, etc.), aditivos alimentarios (vinagre, cido ctrico, carotenos, etc.). (2) productos farmacuticos: antibiticos -lactmicos (penicilinas y cefalosporinas), antibiticos aminoglicsidos y tetraciclinas; compuestos antitumorales y otros frmacos (lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar la produccin de colesterol). (3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc. (4) Productos qumicos tales como alcoholes, polisacridos, disolventes (acetona), lpidos, productos base para la produccin de plsticos, etc. (5) Productos recombinantes diseados por ingeniera gentica.

Adems de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos procesos de microbiologa ambiental tales como el tratamiento de residuos slidos y lquidos y en biorremediacin. Estos aspectos sern tratados ms adelante en este curso. 2.- Produccin de vino Se trata de una fermentacin para la fabricacin de un producto de gran volumen y bajo valor aadido. En el proceso, un hongo (Saccharomyces cerevisiae) crece utilizando el azcar (glucosa) presente en el mosto de uva para producir alcohol. El proceso puede esquematizarse como sigue: Vamos a utilizar el estudio de la fermentacin del vino para revisar los factores que intervienen en un proceso industrial estudiando en los prximos apartados

El microorganismo (hongos) El crecimiento de microorganismos El medio de cultivo El proceso de fermentacin

2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los hongos son organismos eucariticos (sus clulas tienen una organizacin interna en orgnulos membranosos) quimiohetertrofos. A continuacin vamos a explicar el concepto de quimiohetertrofo y a describir los principales grupos de hongos. Los organismos necesitan carbono y energa para poder crecer. En la naturaleza las fuentes de energa pueden ser qumicas (energa presente en los enlaces de compuestos qumicos) o lumnica (energa de la luz que se transforma en energa qumica). Por otra parte, las reaccines de xido-reduccin que tienen lugar en los seres vivos requieren donadores de electrones que pueden ser orgnicos o inorgnicos. Por ltimo, el carbono puede encontrarse de dos formas, como carbono orgnico y como carbono inorgnico (CO2). La combinacin de estas posibilidades da lugar a las diferentes categoras de microorganismos en funcin de su nutricin:

Tipo de nutricin Quimiotrofos Fototrofo Organotrofo Litotrofo Autotrofo Heterotrofo Quimioorgano(hetero)trofo Quimiolito(auto)trofo Fotolito(auto)trofo Fotoorgano(hetero)trofo

Fuente de energa Fuente de electrones qumica luz qumica qumica luz luz comp.orgnico comp. inorgnico comp.orgnico comp. inorgnico comp. inorgnico comp.orgnico -

Fuente de carbono -

Ejemplo

inorgnico orgnico orgnico inorgnico inorgnico orgnico

bacterias, animales algunas bacterias

hongos,

bacterias, plantas, algas algunas bacterias, algas

Como puede verse, las bacterias presentan una gran versatilidad metablica. Mucho mayor que la que presentan plantas, animales u hongos. En cualquier caso, los principales microorganismos de inters aplicado industrial pertenecen al grupo de los quimiohetertrofos. El microorganismo responsable de la fermentacin alcohlica de la produccin del vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos unicelulares, a diferencia de otro tipo de hongos a los que conocemos como filamentosos. Sin embargo, biolgicamente, ambos tipos de hongos (unicelulares o filamentosos) son similares. Las levaduras se multiplican en los medios de cultivo como clulas aisladas individuales que se dividen y, de esta forma, aumentan su nmero. En el caso de los hongos filamentoso, sin embargo, las clulas se encuentran contenidas dentro de unos tubos formados por la pared celular. Estos tubos se denominan hifas y van creciendo por sus puntas (crecimiento apical) y ramificndose para formar la colonia que denominamos micelio. Por consiguiente, los hongos filamentosos tienen un crecimiento micelial, mientras que las levaduras no. Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial, slo el borde de la colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial est formada por clulas viejas mientras que el borde de la colonia est formado por clulas jvenes. Las clulas jvenes se encuentran en trofofase (fase de alimentacin y crecimiento), mientras que las clulas viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciacin). Cuando observamos una colonia micelial (por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce slo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la diferenciacin que dar lugar a la formacin de las esporas y a la aparicin del color verdoso caracterstico.

Las clulas jvenes desarrollan la mayora de la actividad metablica del hongo, liberando enzimas al medio y abosorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte, tiene clulas en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una fruta comienza a extenderse por la fuente de plstico en la que se encuentra) o cuando el hongo se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructferos). El crecimiento de un hongo como levadura o como hongo filamentoso est, en algunas ocasiones, regulado por condiciones ambientales, de forma que un mismo hongo puede crecer en ciertas situaciones como levadura y en otras como hongo filamentoso (por ejemplo, los hongos patgenos ustilago maydis y Candida albicans). Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los hongos (levaduras y filamentosos) es diferente de la de las bacterias y de la de las plantas. La pared celular de bacterias est formada por peptidoglicano, mientras que la de hongos por quitina y polisacridos (glcanos) y la de las plantas por celulosa. Por ltimo hay que recordar que como organismos eucariticos que son, los hongos tienen su ncleo diferenciado en el interior de la clula, tienen varios cromosomas, la divisin celular se produce por mitosis (proceso que no ocurre en bacterias) y la produccin de clulas sexuales por meiosis. La clasificacin de los hongos es muy compleja y aqu vamos a ver slo lo ms simple para poder seguir el curso. La clasificacin se basa en dos criterios: (1) si las hifas estn tabicadas (divididas en clulas) o no y (2) dentro de los hongos con hifas tabicadas, en la organizacin de las esporas sexuales.

Los hongos con hifas no tabicadas se denominan Ficomicetos (esta nomenclatura y clsificacin, repito, puede encontrarse de forma diferente en distintos libros). Los ficomicetos son hongos inferiores (en algunos casos se discute si son hongos o no) y viven en ambientes acuosos. Destacan los gneros Mucor que participa en la produccin de algunos tipos de alimentos y Phytophthora alguno de cuyos miembros son patgenos vegetales (P. infestans, por ejemplo). Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases o Ascomicetos. En ellos las esporas sexuales (ascosporas) se encuentran en el interior de una bolsa o asca. Son ejemplos de ascomicetos la levadura S. cerevissiae, los hongos filamentosos Neurospora, y hongos comestibles como las trufas. Son el grupo de hongos ms abundante. o Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales (basidiosporas) se encuentran en el exterior de unas estructuras com forma de maza denominadas basidios. Pertenecen a este grupo levaduras como el patgeno humano Cryptococcus neoformans que produce meningitis en pacientes inmunodeprimidos, el patgeno vegetal Ustilago maydis que produce tumores en los granos del maz, hongos superiores con cuerpos fructiferos complejos (setas) tales como el champin (Agaricus bisporus) y la seta de chopo (Pleurotus ostreatus), etc.

Deuteromicetos. Tradicionalmente se conocan como hongos imperfectos porque en ellos no se haba podido encontrar la forma sexual y, por consiguiente, no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas. Actualmente y mediante el uso de tcnicas de anlisis del ADN se ha podido determinar que la mayora de ellos pertenecen al grupo de los ascomicetos y, por alguna razn, han perdido la posibilidad de realizar la reproduccin sexual. Alguno de los hongos ms importantes en microbiologa industrial son deuteromicetos: Penicillium productor de la penicilina, Aspergillus productor de cido ctrico y de lovastatina; tambin se encuentran en este grupo hongos patgenos vegetales como Trichoderma y Verticillium, y hongos patgenos oportunistas animales tales como Candida albicans

2.2.- Crecimiento celular En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias. Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una fermentacin. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc. Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. Si llamamos N0 al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser: Llamando T al tiempo de generacin y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin anterior puede transformarse en la siguiente: Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta. Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser rpido. En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores. Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente: Esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo as como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado. Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente funcin exponencial: la transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: Esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin con la similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin. Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.

El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relacin de proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:

Donde dS indica la variacin de la concentracin del substrato. Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilizacin del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido:

El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" ms que otros), vara entre diferentes microorganismos (en un smil antropomrfico: hay personas que engordan ms que otras comiendo lo mismo) y vara tambin en funcin de otras condiciones ambientales o fisiolgicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o enfermo o si est en verano o en invierno). Tambin vara el rendimiento en funcin de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos sern revisados ms adelante). Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en funcin de la cantidad de substrato aadido al cultivo, o en funcin de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total 8gramos de clulas, por ejemplo) o de carbono presente en las clulas (aproximadamente el 505 de la masa celular corresponde a carbono).

Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la frmula que relaciona la variacin de biomasa con la de substrato, llegamos a la definicin de un nuevo concepto qs denominado tasa especfica de consumo de substrato por el organismo. La tasa especfica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la velocidad de crecimiento (). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, tambin mayor ser la tasa de crecimiento. Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimientos ms bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta correlacin inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. Por ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la concentracin de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentracin de este no afecta al valor de ; pero cuando el substrato se hace limitante, s existe ese efecto. La expresin matemtica que relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre de ecuacin de Monod y es la siguiente: En esta ecuacin la tasa de crecimiento () depende de la mxima que puede alcanzar el microorganismo, de la concentracin de substrato y de un valor Ks que representa la concentracin de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la mxima. La ecuacin de Monod tendr mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe ser independiente de la concentracin de substrato. 2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposicin con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:

Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la que el microorganismo se adpata a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cintica explicamos en la pgina anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sinio que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias. En la fase de mmuerte decimos que el nmero de microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero qu es un microorganismo vivo en trminos microbiolgicos?. Consideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiolgicamente muertos no tienen porqu estar metablicamente inactivos. 2.4.- Medida del crecimiento microbiano Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros algunos de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida ms fcil) podemos medir el resto. En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de microorganismos. Una informacin ms completa puede encontrarse en la conexin Mtodos de recuento. Los mtodos para el seguimiento de la evolucin de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas microscpicas y de contadores de partculas). Ls mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos. La eleccin de un mtodo de seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso. Entre los mtodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:

1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa de contraste de fase. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas. 2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del tipo Coulter Counter. La operacin de estos sistemas es sencilla (mtodo de empleo) y permite rpidamente determinar el nmero de partculas presentes en una suspensin y la distribucin de sus tamaos. El problema es que no distingue entre clulas vivas y muertas ni entre clulas y agregados de material insoluble presente en la suspensin del cultivo. 3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin permite realizar el recuento de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colormetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad ptica. La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro. 5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs de una membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. 6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisin de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamente las clulas vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado tcnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una operacin on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran

volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminacin. Antes de cerrar este apartado hay que sealar que en la naturaleza hay muchsimos ms microorganismos de los que podemos detectar por la mayora de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar nicamente proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofa y la oligotrofia (inhibicin por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos. 2.5.- Factores ambientales que afectan al crecimiento de microorganismos Una vez visto cmo podemos seguir la evolucin de un cultivo, vamos a recordar que en un proceso de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores nos permite seguir la evolucin de los otros. A continuacin vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y ms adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes: 2.5.1 Temperatura Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento () en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que () es mxima (para las condiciones de concentracin de substrato en que se trabaja, (ver la discusin anterior al respecto). Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente ( 0) y se produce la muerte celular. El incremento de con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones bioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la que tienen lugar. La ausencia de crecimiento (=0) a temperaturas muy bajas se debe a la reduccin de la velocidad de crecimiento y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitacin del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy bajo y las clulas paran de crecer; aunque no tienen porqu comenzar a morir. Sin embargo, cuando la

temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente (como veremos ms adelante) y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro. Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima, mxima y ptima. Tipo de microorganismo Psicrfilo Psicrtrofo Mesfilo Termfilo Temp. mnima Temp. ptima -5 + 5 12 - 15 -5 + 5 25 - 30 5 - 15 30 - 45 40 - 45 55 - 75 Temp. mxima 15 - 20 30 - 35 35 - 47 60 - 90

Adems de los indicados existen organismos hipertermfilos que pueden crecer a temperaturas cercanas o incluso superiores a 100C en condiciones de alta presin. Son microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales en agronoma o en microbiologa industrial. Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 C). Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la esterilizacin de los cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado, tienen inters aplicado en el campo de la termodestruccin de microorganismos y en algunos procesos de fermentacin en los que el incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos mesfilos patgenos presentes. Importancia de los microorganismos de ambientes extremos La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada tanto en microbiologa industrial como alimentaria son mesfilos, psicrfilos o psicrtrofos. En los procesos de compostaje, el papel de los termfilos es importante, y tambin hay que considerar la presencia de esporas termoresistentes en el estudio de los tratamientos trmicos de termodestruccin de microorganismos en alimentos. Sin embargo, es creciente el nmero de productos que se producen partiendo de microorganismos termfilos porque producen protenas termorresistentes que tienen gran utilidad en procesos aplicados. Quiz el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq obtenida a partir de la eubacteria termfila Thermus aquaticus. Esta enzima permite sintetizar in vitro ADN a alata temperatura lo que ha sido esencial para el desarrollo de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (conocida por sus iniciales en ingls: PCR) lo cual ha

supuesto un avance en la biologa molecular, el diagnstico y la deteccin de microorganismos en los ambientes ms variados. Aplicacin de la temperatura en la termodestruccin de microorganismos Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilizacin para la esterilizacin por calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y de forma controlada mediante tratamientos trminos. En esta seccin veremos cmo se puede predecir cmno ser la evolucin de las poblaciones microbianas como consecuencia de su exposicin a latas temperaturas. Habamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la desaparicin de microorganismos segua la cintica descrita en la ecuacin siguiente:

La fase de muerte tambin sigue una cintica exponencial y puede ser sometida a un tratamiento matemtico similar al usado para el tratamiento matemtico del crecimiento. Si representamos la variacin del logaritmo del nmero de clulas supervivientes a un tratamiento trmico realizado a una temperatura dada en funcin del tiempo de tratamiento, se obtiene una grfica como la siguiente:

El descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestruccin. Se define el valor D como el tiempo necesario para que el nmero de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del nmero de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N0 como el nmero de clulas al inicio del tratamiento y Nx el nmero de clulas supervivientes despus de un tratamiento de x minutos a una temperatura t, el tiempo de termodestruccin se calcula de la siguiente manera:

Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestruccin (D) vara para cada temperatura (de ah el subndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiolgicas. Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logartmica tal y como se indica en la siguiente grfica:

De manera anloga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el nmero de supervivientes se redujera al 10% de la poblacin inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en nmero de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la dcima parte del inicial. La frmulaincluida en la grfica permite calcular el valor z cuando conocemos el incremeto de temperatura (t2-t1) y los respectivos valores D. Los valores d y z varan para cada microorganismo y para cada condicin. Las esporas, por ejemplo, tienen valores D mucho ms altos que las clulas vegetaticas de los mismos microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener valores D ms altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento trmico para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z. Otro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la microbiologa de la termodestruccin es el parmetro F que corresponde al tiempo equivalente (medido en minutos de tratamiento a 250F, o 121.1C) a todo el calor recibido considerando su capacidad de destruir microorganismos. Al valor de la integral del calor recibido se la denomina F0. Cuando consideramos que el calentamiento es un proceso instantneo, se puede calcular usando la siguiente frmula:

Es muy importante saber trabajar correctamente con los conceptos anteriores. Otros tratamientos tecnolgicos para destruir microorganismos (radiacin, por ejemplo) son susceptibles de tratamientos matemticos similares a los descritos en esta seccin. Consideraciones sobre las bajas temperaturas Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma diferente segn se trate de condiciones de refrigeracin (0C-8C) o de congelaci0on (por debajo de -20C). En condiciones de refrigeracin los microorganismos mesfilos y termfilos detienen su crecimiento (=0) y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los psicrfilos y psicrtrofos pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeracin). En condiciones de congelacin, la formacin de cristales en el interior de las clulas produce unas altas mortalidades que reducen el tamao de la poblacin. En el momento de la congelacin se produce la muerte rpida de muchos microorganismos y, a tiempos ms largos, la tasa de muerte se reduce aunque el nmero de viables sigue disminuyendo. En esta segunda fase, la mortalidad es ms rpida cuando la temperatura de congelacin es ms alta (ms prxima a valores de -20C) que cuando es menor (valores de -80C). La tolerancia a la congelacin de diferentes microorganismos puede variar. No se puede considerar la congelacin un procedimiento de esterilizacin sino slo (en el caso de microbiologa de alimentos) un procedimiento de conservacin. Se pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de clulas eucariticas congelados en medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol. 2.5.2 Actividad de agua Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura (P0):

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la actividad de agua mucho

menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa (HR) de la siguiente forma:

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad del agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: Bactrias Levaduras Hongos filamentosos

aw >0.90, aw >0.85, aw >0.80.

Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua muchos menores (mucos ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. Existen microorganismos extremadamente tolerantes a las actividades muy bajas (toleran valores de aw=0.60). Algunos de estos microorganismos pertenecen al grupo de las Arqueas y pueden observarse en las salinas de desecacin formando manchas coloreadas en los depsitos de sal. La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 2.5.3 Potencial del Ion Hidrogeno (pH) Es un parmetro crtico en el cultivo de microorganismos ya que estos slo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.

Cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango muere. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10.0 El pH interno en la mayora de los microorganismos est en el rango de 6.0 a 7.0.

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos industriales para evitar que un descenso excesivo pueda producir la autoesterilizacin del cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas que producen grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lcticas se convierten en la poblacin dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos de cadena corta es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son txicos para algunas bacterias por s mismos. En resumen, es necesario controlar el pH de los cultivos y de las fermentaciones industriales para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metabolismo correcto del microorganismo con el que se trabaja. Por otro lado, el efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la conservacin de alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido actico en forma de vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la produccin de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo). 2.5.4. Potencial REDOX y Concentracin de oxgeno Este es otro factor determinante del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial Redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial Redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables como veremos ms adelante. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se produzca el crecimiento.

En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio cuando no lo necesita (existen anaerobios facultativos como las bacterias entricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lcticas) o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxgeno (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que acta como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran" nitratos (NO3-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgnicos oxidados. Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxgeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lcticas, por ejemplo). Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxgeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento (Ys) de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos, por ejemplo las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.

La levadura Saccharomyces cerevisiae desarrolla ambos tipos de metabolismo; pero slo produce etanol en condiciones de crecimiento anaerobio (fermentativo). Por consiguiente, y en general, al preparar un cultivo industrial debemos saber: (1) En qu condiciones metablicas se produce lo que nos interesa fabricar y (2) Controlar la fermentacin industrial para que se produzca en esas condiciones deseadas. En el curso de ciertas reacciones metablicas Redox, se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas de sperxido) que pueden daar las protenas, membranas y cidos nucleicos produciendo la muerte de las clulas. Estas formas reactivas son un subproducto del metabolismo respirativo (algo as como el precio que hay que pagar por ser ms eficientes y tener un (Ys) mayor. Las clulas se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes:

Los organismos aerobios tienen SOD y muchos de ellos catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxgeno.

2.5.5 Radiacin Las radiaciones ultravioleta (UV), Rayos X y radiacin Gamma () producen efectos esterilizantes (destruccin de microorganismos) al alterar las protenas, membranas, cidos nucleicos y al generar radicales libres del tipo OH- y H+. El tratamiento matemtico de la destruccin de microorganismos por estos procedimientos es similar al descrito para el uso de altas temperaturas. Hay que considerar, sin embargo, los poderes de penetracin de los diferentes tipos de radiacin. As, por ejemplo, la radiacin UV tiene un poder de penetracin muy bajo y, por consiguiente, se utiliza para esterilizar superficies, mientras que la radiacin X o la tiene poderes de penetracin mucho mayores. La resistencia de diferentes tipos de microorganismos a las radiaciones vara. Las esporas bacterianas, las bacterias, levaduras, hongos filamentosos y otras clulas eucariticas son progresivamente ms sensibles a las radiaciones. Hay algunos microorganismos especialmente resistentes a las radiaciones, entre ellos destaca Deinococcus radiodurans. 2.5.6 Presin hidrosttica Las altas presiones inhiben el crecimiento de los microorganismos. Esto limita la altura de los fermentadores que se pueden utilizar sin que las altas presiones hidrostticas del fondo inhiban el crecimiento. La altura de los fermentadores, por tanto, se suele limitar a un mximo de 14.5 m (lo que genera una presin de 1.5 atm). La razn por la que las altas presiones inhiben el crecimiento no est clara, aunque se ha visto que se detiene la sntesis de protenas y los procesos catablicos. Tambin en este caso hay una gran variabilidad en la tolerancia de los microorganismos a las altas presiones. En este sentido, hay que sealar a los microorganismos barfilos que han sido aislados de fosas ocenicas y que crecen sometidos a presiones extraordinariamente elevadas. Desde el punto de vista aplicado y a parte de la consideracin hecha sobre el tamao de los fermentadores, el efecto de la presin sobre el crecimiento de los microorganismos tiene importancia en el desarrollo de sistemas de eliminacin de microorganismos en alimentos mediante altas presiones y en la consideracin de los microorganismos que participan en procesos en los que aumenta la presin tales como la fabricacin de vinos espumosos.

METABOLISMO MICROBIANO:
1.- Introduccin Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo. Para los microorganismos con los que vamos a trabajar, normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el siguiente esquema general del metabolismo:

Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad de energa para mantenerse ordenados. Esta energa se obtiene de la oxidacin de compuestos orgnicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la oxidacin, se libera energa (que se acumula en forma de molculas almacenadoras de energa, especialmente el ATP) y se producen elementos estructurales que servirn para la construccin de nuevas clulas (crecimiento y diferenciacin). Al proceso por el que se obtiene energa y elementos estructurales bsicos a partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energa obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que aunque se estudie de forma separada el anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos ocurren simultneamente de forma que conforme se van produciendo elementos estructurales y energa en el catabolismo, esos elementos se usan para formar nuevos componentes celulares en procesos anablicos. A los productos metablicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar durante el crecimiento (trofofase) se les denomina metabolitos primarios y su produccin es paralela al crecimiento celular. Por el contrario, los productos metablicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciacin celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general, puede decirse que los metabolitos secundarios se producen despus de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones (como en cultivo continuo) se pueden producir simultneamente. Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia reducida que puede oxidarse para la produccin de energa o utilizarse para la biosntesis de nuevos elementos estructurales.

No todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse completamente ya que parte se utilizar para sintetizar nueva biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se utiliza para la produccin de biomasa y, por consiguiente, el rendimiento (medido tal y como se describi en otro apartado de estas notas) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en muchos casos). La oxidacin de los nutrientes consiste en la captacin de electrones de un compuesto reducido por parte de un agente oxidante que llamaremos aceptor final de electrones. Este aceptor final puede ser inorgnico: oxgeno (con G0`= -237 kJ) o NO3- (con G0`= -163 kJ); o compuestos orgnicos tales como el fumarato (con G0`= -86 kJ). Cuanto ms negativo sea el valor de G0`, mayor cantidad de energa se podr obtener de la oxidacin y ms eficiente ser el proceso. Por esto, puede verse que la oxidacin en la que el aceptor final de electrones es el O2 es la que ms rendimiento de produccin de energa permite. En las pginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidacin biolgica de una molcula reducida sealando los pasos en los que se produce la liberacin de energa. El esquema general del metabolismo se construye en torno al proceso de oxidacin de la glucosa. La ecuacin general de oxidacin de la glucosa es la siguiente: C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O G0`= -1330 kJ/mol

En el proceso de oxidacin biolgica de la glucosa, los productos finales (CO2, H2O y la energa) se producen en sitios diferentes en la clula: el CO2 se produce en reacciones de descarboxilacin, mientras que el H2O y la energa se producen principalmente en la membrana celular como resultado de la cadena transportadora de electrones y de la actividad de la ATPasa de membrana. 2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis) El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos referiremos como C6) puede ocurrir por cuatro vas diferentes: (1) Ruta de Embden-Meyerhof (EM). Es la ms comn en todo tipo de organismos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas citoplsmicas. La mayora de los pasos de la ruta son reversibles, aunque hay tres (los catalizados por las enzimas hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) que son irreversibles. En los procesos anablicos hay unos desvos metablicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es el siguiente: Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+ Como resultado de esta ruta se obtiene una pequea cantidad de energa (dos moles de ATP por mol de glucosa) por procesos de fosforilacin a nivel de substrato, se obtienen dos moles de

NAD reducido (NADH+ H+) y se ha logrado una oxidacin parcial del carbono de la glucosa para producir como metabolito final dos moles de piruvato por mol de glucosa catabolizada. (2) Ruta de las Pentosas Fosfato (PF). Esta ruta est presente en muchas bacterias y en la mayora de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo simultneamente a la ruta EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza por la ruta PF (el porcentaje puede ser an mayor en condiciones de crecimiento rpido) y el resto por la EM. La ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en procesos catablicos y en anablicos tales como en la sntesis de nucletidos y de aminocidos aromticos. La ecuacin general de la ruta PF es la siguiente: 3 Glucosa-6-fosfato (C6) + 6NADP+ H2Ofructosa-6-fosfato (C6) + gliceraldehido-3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H+ Como resultado, no se produce energa, aunque s ocurren una descarboxilacin. La fructosa-6fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por ltimo, los seis moles de NADPH+ H+ producidos en la ecuacin se usan como "poder reductor" en procesos anablicos. (3) Ruta de Etner-Doudoroff (ED). Es una ruta usada por un nmero reducido de microorganismos carentes de la ruta EM. La mayora son bacterias Gramnegativas tales como Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y Zymomonas. La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la ruta ED es el siguiente: Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+ Como puede verse, el rendimiento energtico es menor que en la ruta EM. (4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen ciertas bacterias lcticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc). Se puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un azucar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilacin. sin embargo, en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azcar C5 y da lugar a dos ramas que condicen a la formacin de lactato y etanol en un proceso de fermentacin heterolctica. El metabolito final ms relevante de esta primera fase del catabolismo de la glucosa es el cido pirvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF (en esta ruta, tal y como se ha descrito, se forman intermediarios que pueden conducir a la formacin de piruvato). El metabolismo central contina, pues, con el catabolismo del piruvato.

PROCESOS METABLICOS FERMENTATIVOS

1.- Concepto de fermentacin La palabra fermentacin es confusa en Microbiologa porque con ella se hace referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en ausencia de oxgeno, la produccin de metabolitos secundarios, la modificacin de compuestos qumicos por microorganismos en crecimiento y el crecimiento bacteriano en s cuando el inters del cultivo es la produccin de biomasa. El sentido en que vamos a utilizarla en estas notas es el primero: fermentacin es el proceso por el que las clulas pueden obtener energa sin llevar a cabo un proceso de fosforilacin oxidativa. Esto es: En la fermentacin, la energa se obtiene mediante un proceso qumico de fosforilacin a nivel de substrato sin que se produzca una variacin neta del poder reductor de la clula. Los primeros estudios cientficos serios sobre procesos de fermentacin se llevaron a cabo por Pasteur en el anlisis de los procesos de produccin y alteracin del alcohol durante la fabricacin del vino. Los procesos de fermentacin son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas ms antiguas de conservacin de la energa. 1.1.- Diferencias entre fermentacin y respiracin: En los procesos de fermentacin la energa qumica tambin deriva de la oxidacin de compuestos reducidos. En cualquier proceso de oxidacin se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la liberacin de energa. En los procesos oxidativos el aceptor final de los electrones de la oxidacin es el oxgeno o, de una manera ms general, cualquier compuesto inorgnico oxidado. Sin embargo, en los procesos fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un aceptor final que es un compuesto orgnico oxidado. Por consiguiente, en un proceso de fermentacin tanto el donador de electrones como el aceptor son compuestos orgnicos, mientras que en un proceso de respiracin el donador de los electrones es orgnico y el aceptor inorgnico. Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de respiracin el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en un proceso de fermentacin el aceptor final es interno. La respiracin es mucho ms efectiva energticamente que la fermentacin porque en aqulla la oxidacin del compuesto orgnico es ms completa que en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol (Go) en la respiracin de glucosa y slo 58 kcal/mol en la fermentacin. (Estos valores hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la sntesis de ATP). Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxgeno como aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de oxgeno slo se pueda producir fermentacin: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgnico oxidado que los reciba al

final de la cadena respiratoria producindose un proceso de fosforilacin oxidativa en ausencia de oxgeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras molculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO3--) y los sulfatos (SO4=). 2.- Rutas fermentativas para la utilizacin del piruvato En la oxidacin de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles de ATP como rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen dos) y se genera tambin un mol de NADH+H+. Cuando se produce la entrada en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una gran cantidad de NADH+H+ que se reoxida principalmente mediante la fosforilacin oxidativa. Cuando una clula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrgeno necesario para las primeras fases de la glicolisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metablicos iniciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentacin que se conocen por sus productos finales. 2.1.- Fermentacin Etanlica o alcohlica: En esta, el piruvato se reduce para formar etanol y CO2: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP Este es el proceso de fermentacin que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas (pocas) bacterias. Su importancia industrial es evidente: la fermentacin alcohlica produce el alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino, cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta fermentacin es el causante del esponjamiento de la masa de pan durante su fermentacin. En este ltimo caso el proceso de coccin posterior durante la fabricacin permite eliminar todo el alcohol de manera que no queda presente en el producto final. 2.2.- Fermentacin homolctica: Se denomina as la fermentacin cuyo nico producto final es el cido lctico. Su ecuacin global es: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 cido lctico + 2 ATP Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de EmbdenMeyerhof (va glucoltica clsica). Es un proceso de fermentacin presente en muchas bacterias del grupo lctico: Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus.

Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se encuentran estas bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la liberacin de cido lctico es suficiente para producir unos cambios qumicos en el producto (precipitacin de protenas durante el cuajado de la leche), cambios microbiolgico (proteccin del deterioro microbiano de alimentos como consecuencia de la eliminacin de la flora competidora) y organolpticos (los cidos orgnicos de cadena corta, y entre ellos el cido lctico tienen caractersticas de produccin de sabor) que hacen de esta fermentacin un proceso muy relevante en la produccin de alimentos. La fermentacin homolctica es la causante de las agujetas (Sensacion de pinchadas) producidas en los msculos despus de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxgeno aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la reoxidacin del NADH+H+. Las agujetas se producen por los depsitos de cido lctico entre las fibras musculares. Asimismo, la fermentacin homolctica es responsable de la alteracin del esmalte dental en la boca causado por bacterias lctica (flora habitual). 2.3.- Fermentacin heterolctica: Denominada as porque su producto final no es exclusivamente cido lctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentacin homolctica como se desprende de la produccin de slo un mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtencin del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas. La reaccin global es: Glucosa + ADP + Pi Ac. lctico + etanol + CO2 + ATP Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo lctico pertenecientes a los gneros Leuconostoc y Lactobacillus. Industrialmente el proceso es relevante en la produccin de alimentos fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo de fermentacin es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche. 2.4.- Fermentacin del cido propinico: Las bacterias que presentan este tipo de fermentacin se pueden utilizar tanto azcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y cido propinico como productos finales. Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbvoros donde llevan a cabo una fermentacin secundaria de los productos de las fermentaciones lcticas primarias. Industrialmente Propionibacterium es importante en la fermentacin del queso para producir el tipo suizo: la fermentacin propinica utiliza en este caso el lactato producido en las fermentaciones lcticas primarias produciendo CO2 responsable de los ojos del queso suizo y acumulacin de cidos orgnicos de cadena corta responsables de caractersticas organolpticas. 2.5.- Fermentacin cido-mixta:

La fermentacin cido mixta produce cido actico, etanol, H2 ,CO2 y proporciones diferentes de cido lctico o propinico (frmico) segn las especies. Es un tipo de fermentacin que llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentacin se produce ATP adems de la reoxidacin del NADH+H+. La produccin de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria de una enzima denominada formiato-liasa responsable del paso. No todas las bacterias la tienen y su actividad es detectable por la produccin de grandes cantidades de gas (el H2 es insoluble) como consecuencia de la fermentacin del azcar. 2.6.- Fermentacin butanodilica: Es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentacin cida mixta butanodilica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso intermedio de la ruta se produce acetona que puede servir para la identificacin de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reaccin de Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter. 2.7.- Fermentacin del butanol: Es un tipo de fermentacin llevado a cabo por bacterias anaerobias estrictas del gnero Clostridium. En el curso de esta fermentacin se producen compuestos orgnicos disolventes de gran importancia industrial y que, histricamente, han sido los primeros productos industriales bacterianos de importancia econmica relevante durante la 1 Guerra Mundial (trabajo de Weizmann). 3.- Rutas fermentativas de utilizacin de aminocidos En algunas bacterias del gnero Clostridium se producen procesos acoplados de oxidacin de aminocidos con el objeto de produccin de energa. Como en estos procesos no se utiliza ningn aceptor externo de los electrones de la oxidacin, (el aceptor es el segundo aminocido de la pareja) tcnicamente constituyen procesos de fermentacin de aminocidos, en los que se llega a la desaminacin y descarboxilacin de los aminocidos que intervienen en la pareja. El ejemplo ms representativo es la desaminacin y descarboxilacin oxidativa de la alanina a acetato, acoplada con la desaminacin reductiva de la glicina en el proceso conocido como reaccin de Stickland. 4.- Conclusin Los procesos de fermentacin, en sentido metablico, son aquellos en los que se produce una oxidacin de compuestos orgnicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto orgnico interno que se reduce. En estos procesos puede producirse algn rendimiento energtico; pero su principal funcin es la reoxidacin del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse por sus productos finales.

EXPRESIN DE LA INFORMACIN GENTICA

1.- Ciclo del material gentico El material gentico de cualquier organismo (procarionte o eucarionte) est sometido a una serie de procesos cclicos que aseguran la realizacin de sus dos funciones esenciales: (1) La transmisin entre generaciones de la informacin gentica con fidelidad y (2) La expresin de sa informacin gentica con precisin para que pueda cumplir la misin para la que ha sido seleccionada. Por consiguiente, el ciclo del material gentico comprende tres procesos: (1) Replicacin del material gentico para su transmisin en copias idnticas a la descendencia, (2) Transcripcin del material gentico que se transmite entre generaciones para sintetizar el material gentico que asegura la expresin de la informacin en la clula y (3) Traduccin de la informacin gentica de la forma de cido nucleico a la forma de protenas. Estos tres procesos ocurren independientemente de cul sea la molcula transmisora principal de la informacin gentica entre generaciones (ADN en la mayora de los casos y ARN en el caso de los virus de ARN) y son esencialmente iguales en procariontes y en eucariontes. 1.1.- Replicacin: La replicacin del material gentico es un proceso complejo en el que participa un gran nmero de protenas que reconocen la molcula de material gentico y llevan a cabo la polimerizacin de otras molculas complementarias cada una de sus hebras de forma que, al final, se logra disponer de dos molculas idnticas (salvo errores denominados mutaciones) a la inicial. El proceso presenta ciertas diferencias segn el material gentico que se transmite entre generaciones sea ADN o A RN y, en el primer caso, si el organismo es eucarionte o procarionte. 1.1. 1.- Replicacin del ADN procaritico. En este proceso interviene un grupo de enzimas conocido genricamente como ADN polimerasa. Este complejo multienzimtico va incorporando nucletidos a la cadena que se va sintetizando utilizando como molde una de las hebras de la cadena antigua. Esta polimerizacin se produce aadiendo nuevos nucletidos al extremo 3' de una hebra de ADN en crecimiento. Por ello se dice que la sntesis del ADN se produce en direccin 5'<3' mientras la ADN polimerasa va leyendo la hebra molde en direccin 3'o5'. Por consiguiente, para que se produzca la sntesis de ADN por la ADN polimerasa, adems de la enzima que realiza la polimerizacin en s, es necesario otro juego de protenas que van desenrollando la doble hlice de ADN delante de la ADN polimerasa para permitir que sta funcione. Estas enzimas se denominan genticamente topoisomerasas y girasas. La accin de las topoisomerasas y girasas permite abrir unas burbujas en la doble hlice de ADN en las que entra el complejo de la ADN polimerasa y realiza la polimerizacin.

Sin embargo, la ADN polimerasa no es capaz de iniciar la polimerizacin del ADN sino que solamente es capaz de continuarla. Para que la ADN polimerasa funcione es necesario que exista un extremo 3' libre al que aadir un nuevo nucletido. Quin pone ese extremo 3' libre?. En todos los casos (salvo algunas excepciones de ciertos virus) se extremo 3' viene de una pequea cadena de ARN que se ha sintetizado como paso inicial de la replicacin del ADN. Por consiguiente, la replicacin del ADN comienza con la sntesis de una pequea molcula de ARN que luego contina como molcula de ADN. Esta pequea molcula de ARN se denomina cebador o primer y es sintetizada por otro complejo multienzimtico denominado ARN polimerasa. La sntesis de ADN (replicacin) va procediendo detrs de la horquilla que se forma en el punto en que se van abriendo las dos hebras de ADN molde por accin del complejo de girasas y topoisomerasas. De esta forma, la hebra que se va sintetizando es continua. Sin embargo, la hebra que se sintetiza usando como molde la complementaria de la anterior no puede ser continua porque la accin de las topoisomerasas y girasas se produce detrs del punto de origen de la transcripcin. Por esto, de las dos hebras hijas, una ser continua y l a otra discontinua. Los fragmentos de sta ltima se unirn entre s mediante la accin de otra enzima denominada ADN ligasa que une los fragmentos anteriores. En las bacterias, cuyo material gentico es cerrado, no tiene extremos, slo existe un origen de replicacin del ADN en cada molcula de ADN. Esto es vlido para los plsmidos y para los cromosomas bacterianos. Asimismo, esto se cumple tambin en el ADN de los orgnulos celulares procariticos presentes en las clulas eucariticas. 1 12.- Replicacin del ADN eucaritico. La replicacin del ADN eucaritico es esencialmente igual a la del procaritico aunque presenta ciertas diferencias los cromosomas eucariticos son abiertos, en lugar de cerrados, y el nmero de orgenes de transcripcin es mltiple en cada cromosoma en lugar de tener uno solo por cromosoma. 1.1.3.- Replicacin del material gentico de los virus de ARN. Los virus de ARN tienen esta molcula como transmisora de la in formacin gentica entre generaciones. Para la transmisin de las copias de informacin gentica entre los descendientes es necesario que el ARN del virus que infecta una clula se transcriba, en primer lugar, en una molcula de ADN que servir como molde para la copia de muchas molculas de ARN que formarn la descendencia. Esta transcripcin de ARN a ADN se produce en direccin opuesta a la transcripcin clsica que hemos descrito antes (ADN < ARN) y se lleva a cabo por un complejo multienzimtico en el que el constituyente principal es la enzima denominada transcriptasa reversa. 1.2.- Transcripcin: Es el proceso por el que se transmite la in formacin contenida en el ADN al ARN. Este proceso se lleva a cabo por la ARN polimerasa que utiliza como molde una de las dos hebras del ADN, la denominada hebra codificante. Durante el proceso de transcripcin se reconoce un sitio especfico de la molcula de ADN en el que se van a unir las enzimas del complejo de ARN polimerasa. Este sitio especfico se denomina promotor del gen y permite que se produzca la

transcripcin. Genes sin promotores no pueden ser transcritos aunque un promotor puede servir para transcribir varios genes seguidos que forman lo que se denomina un opern. En clulas procariticas existe una serie de protenas que pueden un irse a la ARN polimerasa controlando a qu promotores se puede unir sta y regulando as la expresin gnica. Estas protenas se denominan factores sigma. En clulas eucariticas la unin de la ARN polimerasa a un promotor o a otro viene regulada por la unin de otras muchas protenas que, de alguna forma, dirigen la unin de la polimerasa al promotor conveniente. No todas las molculas de ARN que se sintetizan en una clula van a ser traducidas en protenas. La gran mayora de las molculas de ARN tienen otras funciones estructurales o enzimticas diferentes de la transmisin de la informacin gentica. Son las molculas de ARN transferente (que sirve para activar los aminocidos de manera que puedan ser polimerizados en protenas) y las de ARN ribosomal que sirven para que estos orgnulos celulares puedan desarrollar su funcin. Constantemente se van encontrando nuevas molculas de ARN con funcin diferente a la de transmisin de la informacin gentica. En cualquier caso, stas molculas especiales de ARN son sintetizadas por un procedimiento de transcripcin similar al descrito aunque el complejo enzimtico de la ARN polimerasa pueda ser algo diferente. 1.3.- Traduccin: Es el proceso por el que la informacin gentica con tenida en el ADN y transcrita en una ARN mensajero va a ser til izada para sintetizar una protena. El proceso de lleva a cabo en los ribosomas. Para que un ribosoma pueda reconocer una ARN mensajero y utilizarlo para sintetizar una protena, el ARN tiene que contener, adems de la serie de nucletidos que llevan la secuencia de la protena, otras secuencias que permitan al ribosoma unirse al ARN, saber dnde ha de iniciarse la traduccin de la secuencia (el denominado codn de iniciacin), saber dnde debe terminar la traduccin (codn de terminacin) y saber en qu punto de la molcula de ARN mensajero deben separarse ste y el ribosoma. Los ribosomas de las clulas procariticas son diferentes de los de l as clulas eucariticas como puede comprobarse por su diferente susceptibilidad a antibiticos ribosomales. Por otra parte, la traduccin en clulas procariticas ocurre simultneamente a la transcripcin del gen, mientras que en las clulas eucariticas, la traduccin se produce slo una vez que el ARN mensajero ha llegado al citoplasma y a la zona donde se encuentran los ribosomas, por lo que nunca es simultnea con la transcripcin. La traduccin del mensaje gentico desde el ARNm hasta una protena no es suficiente, en algunos casos, para que se exprese correctamente. Es necesario que el polipptido que se va sintetizan do por el ribosoma se pliegue de forma adecuada para que pueda desarrollar su funcin biolgica correctamente; sin embargo, en muchos casos esto no ocurre de una manera completamente espontnea: es necesario el concurso de un grupo de protenas esenciales denominadas chaperoninas (anglicismo que viene a significar protenas tutoras o, si se quiere, tutorinas) que ayudan al pptido naciente a adquirir la configuracin tridimensional correcta.

Estas protenas son muy importantes, por otra parte, para corregir errores pequeos que se produzcan en protenas maduras y que causan su inactivacin o bajada de rendimiento. 1.3.1.- Modificaciones del ARN mensajero: Tiene que producirse una serie de modificaciones en el ARN mensajero para que pueda ser traducido correctamente. En las clulas eucariticas las molculas de ARN deben ser trasladadas del ncleo, donde ocurre la transcripcin, al citoplasma, donde ocurre la traduccin. Por otra parte, l os genes de organismos eucariticos suelen tener fragmentos que no se traducen pero si se transcriben, son los denominados intrones por contraposicin a los exones o secuencias del ARN que van a ser traducidas. Cuando se transcribe un ARN eucaritico ste es una secuencia de intrones y exones que debe ser procesada para eliminar los intrones y dejar slo los exones colocados ordenadamente. Esta eliminacin selectiva de intrones se denomina tcnicamente procesamiento o splicing, y ocurre en el ncleo. En los genes procariticos no existen (salvo alguna excepcin muy rara en un grupo especial de arqueobacterias) intrones y, por lo tanto, no hay procesamiento. 1.4.- Aplicaciones de los procesos y sistemas enzimticos que intervienen en el ciclo del material gentico, en la ingeniera gentica y la Biotecnologa: Los procesos y sistemas enzimticos involucrados en la transmisin y expresin de la informacin gentica entre generaciones pueden ser aislados y utilizados en la Biotecnologa para lograr la expresin y manipulacin de informacin gentica por microorganismos e, incluso, por organismos superiores. Como ejemplo citaremos dos aplicaciones derivadas de las propiedades y enzimas involucradas en la replicacin del ADN. 1.4.1.- Deteccin se secuencias de ADN o ARN mediante hibridacin de cidos nucleicos. Estas tcnicas estn basadas en la especificidad de la unin de hebras de cidos nucleicos con secuencias complementarias. Dependiendo de la perfeccin del acoplamiento de las dos secuencias (del grado de complementariedad) la unin entre las dos cadenas ser ms o menos fuerte. Esto significa que podr resistir temperaturas ms elevadas cuando la complementariedad es ms alta o se separarn las hebras (se producir la fusin) cuando la complementariedad es demasiado baja. En cualquier caso, las hebras se mantendrn unidas o no dependiendo del binomio grado de complementariedad-temperatura. La especificidad de la unin de hebras nos permite detectar la presencia de secuencias en una molcula, o en una mezcla de molculas, de cido nucleico (ADN o ARN) usando como sonda una molcula con secuencia complementaria y convenientemente marcada para facilitar su deteccin. Estos procedimientos se utilizan en hibridacin in situ, experimentos de Southern (deteccin de secuencias de ADN) o en experimentos de Northern (deteccin de secuencias de ARN). 1 4.2.- Amplificacin de secuencias de cidos nucleicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa: en esta tcnica se utiliza la capacidad de la ADN polimerasa de sintetizar ADN a partir de una secuencia cebadora determinada. En ella se usan dos cebadores que flanqueen una secuencia de ADN que se quiere detectar o de la que se desea disponer de un gran nmero de copias; estos cebadores deben servir para iniciar la sntesis de ADN en cada una de las dos hebras del fragmento que se quiere amplificar y, por consiguiente, deben estar

<(orientados hacia el interior de la secuencia que se quiere amplificar. Mediante la adicin de ADN polimerasa y de los cofactores y substratos necesarios es posible realizar la sntesis de la molcula de ADN flanqueada por los dos cebadores in vitro. Si, adems, se realizan varios procesos de sntesis de ADN usando los mismos cebadores en procesos consecutivos el nmero de copias de l a molcula, de ADN que se quiere amplificar aumentar exponencial mente permitiendo disponer de grandes cantidades de la misma. En la prctica, esta reaccin de polimerizacin se lleva a cabo con la ADN polimerasa de una bacteria termfila (Thermus aquaticus u otras similares) capaz de resistir mltiples ciclos a elevada temperatura (Taq-polimerasa). La tcnica tambin se puede utilizar para detectar ARN siempre y cuando se realice un paso previo de transcripcin reversa dei mismo. 2.- Control de la expresin gnica La transmisin de la informacin gentica entre generaciones y la expresin en forma de protenas de dicha informacin gentica no son suficientes para permitir que el programa de desarrollo de un organismo se lleve a cabo correctamente. Es necesario, adems, asegurar que los genes que constituyen la informacin gentica transmitida se expresen en momentos adecuados bien desde el punto de vista cronolgico o espacial (procesos de desarrollo) o bien como respuesta a cambios en las condiciones ambientales en las que se encuentra la clula o el individuo. Por otra parte, las respuestas al ambiente o los procesos de desarrollo no suelen producirse como con secuencia de la activacin de un nico gen en un momento, sitio o condicin determinado, sino que suele ser necesaria la expresin coordinada de un conjunto de ellos para que tenga lugar el efecto. Estos dos hechos hacen que el control de la expresin gnica sea central en el proceso de la biologa molecular de los seres vivos. El modelo ms coherente de regulacin de la expresin gnica se conoce con el nombre de Modelo del Opern que explica, como veremos, l a expresin coordinada de genes. Por otra parte, veremos a continuacin cul es el proceso por el que llega al material gentico la in formacin ambiental o de desarrollo que permita la expresin coordinada; estudiaremos el proceso de transduccin de la seal. 2.1.- Modelo del opern: La expresin de un grupo de secuencias codificantes de diferentes pptidos cuya presencia debe ser coordinada se logra colocando todas las secuencias bajo el control de un mismo promotor. La transcripcin de todas estas secuencias darn lugar a un ARN mensajero de gran tamao que codifica todos los genes contenidos en el opern (ARN policistrnico) de forma que siempre se podrn traducir coordinadamente las diferentes protenas del opern. La cantidad de cada una de las protenas del opern que se produce como consecuencia de la traduccin no siempre es equimolecular porque existen elementos de regulacin de la traduccin que provocan la separacin del ribosoma y el ARNm en ciertos momentos controlando as ms finamente la coordinacin de la expresin. Cmo se regula de la expresin gnica?. Entre el promotor del opern y el inicio del primer gen estructural del fragmento policistrnico existe una secuencia de ADN denominada Operador. A

esta secuencia se puede unir una protena denominada Regulador de forma que cuando se encuentra unido el regulador a la secuencia del operador impide el paso de la ARN polimerasa en su trayecto de transcripcin del ADN para sintetizar el ARN policistrnico. Por con siguiente, la regulacin de la expresin se logra mediante un impedimento fsico de la actividad de la ARN polimerasa causado por la unin de una protena al ADN. Existen dos clases de operones segn sea su respuesta a las condiciones ambientales: los operones inducibles y los operones represibles. 2.1.1.- Opern inducible: es aqul en el que como consecuencia de la presencia de una molcula inductora se produce la expresin de los genes del opern. El ejemplo ms clsico es el del Opern de la lactosa que regula la sntesis de las protenas que permiten el metabolismo de la lactosa por las bacterias. Cuando una bacteria se encuentra en un ambiente donde puede disponer de lactosa los genes que hacen posible la utilizacin de este azcar por la bacteria se inducen. Estos genes, agrupados en el Opern de la lactosa, estn constitutivamente reprimidos porque a la regin del operador del opern se ha unido una protena inhibidora que impide el paso de la ARN polimerasa. Cuando hay lactosa en el medio de crecimiento alguna molcula de este azcar puede llegar al interior de la clula usando alguno de los sistemas de transporte presentes en la membrana bacteriana para azcares. Una vez en el interior de la clula, la lactosa puede unirse a la protena inhibidora unida a la regin reguladora del opern de la lactosa de suerte que, cuando la lactosa est unida, la protena inhibidora se separa de la regin operadora permitiendo el paso de la ARN polimerasa y la transcripcin de los genes correspondientes. Cuando desaparece la lactosa del medio la protena inhibidora queda de nuevo libre de forma que puede volver a unirse al fragmento operador del opern impidiendo, de nuevo, la transcripcin de los gen es que lo forman. El resultado de este proceso es que, como respuesta a la presencia de lactosa en el medio, se induce la expresin de los genes que permiten su catabolismo. Este sistema es extremadamente sensible porque la accin de las enzimas que permiten el paso de la lactosa a travs de la membrana (transportadoras de lactosa) permite que la concentracin intracelular de lactosa sea suficientemente alta hasta el momento en el que la concentracin extracelular es ya tan baja que no puede utilizarse el azcar eficientemente. 2.1.2.- Opern represible: en otros casos es necesario que la expresin de ciertos genes se detenga tan pronto como sea metablicamente posible, porque su actividad no sea necesaria, para lograr una mayor economa de la energa celular. Es el caso, por ejemplo, de los operones de la arginina y del triptfano. Estudiaremos con ms detalle el primero de ellos. Si la cantidad de arginina presente en la protenas que se encuentran en el medio en que crece una bacteria es suficientemente alta como para satisfacer las necesidades bacterianas de este aminocido, no es necesario que la bacteria lo sintetice sino que, simplemente, lo asimila de la dieta. Ahora bien, si la cantidad de arginina exgena no fuera suficiente, las bacterias pueden sintetizarla a partir de otros precursores mediante el concurso de una serie de enzimas codificadas en el opern de la arginina.

De nuevo, nos encontramos con un opern y a su secuencia operadora se une una protena represora especfica. Sin embargo, en este caso l a protena represora se mantiene unida siempre que a ella se encuentre unida, a su vez, una molcula de arginina o de un anlogo de arginina. Cuando la concentracin celular de arginina desciende por debajo de unos niveles crticos (que vienen determinados por la constante de afinidad de la molcula represora por la arginina o su anlogo) el represor se separa de la arginina y queda inactivo separndose, tambin, de la secuencia operadora y permitiendo la transcripcin de los genes que codifican las protenas de sntesis endgena de arginina. El efecto final es la expresin de los genes del opern como respuesta a los niveles de arginina presentes en la clula. 2.2.- Mecanismos de transduccin de seal. Se conocen con este nombre los mecanismos que permiten a las clulas sentir condiciones exteriores (ambientales o seales de desarrollo) y activar como consecuencia de ello la expresin de algunos genes u operones. Los dos ejemplos de opern descritos anteriormente responden a las condiciones ambientales de concentracin de lactosa y arginina, respectivamente; sin embargo, no se consideran incluidos dentro de l os mecanismos de transduccin de seal porque la deteccin del estado ambiental no se realiza a travs de la membrana bacteriana sino que se produce directamente por interaccin del inductor con el represor modulando su unin al operador. En el caso de los sistemas de transduccin de sea, un complejo de protenas de membrana recibe la seal externa. Para ello, este complejo ha de tener una protena, al menos, dirigida hacia el exterior de l a clula de manera que acte como receptor de la seal. Como con secuencia de la deteccin de la seal (lo que, en trminos bioqumicos suele significar "cuando se ha unido I receptor de membrana la molcula que acta como inductor") se produce un cambio conformacional en la molcula del receptor; cambio que, a su vez, causa otros en las otras protenas del complejo de membrana con las que interacciona. Como consecuencia de estos cambios estructurales el complejo de protenas, por su cara interna, es capaz de modificar qumicamente protenas citoplsmicas activando o inactivando as su funcin como represores de operones o genes (esto suele ocurrir mediante procesos de fosforilacin) o bien sintetiza molculas que son inductores que regulan la actividad de represores presentes en la clula (estas molculas inductoras son lo que se suele denominar colectivamente "segundos mensajeros"). Los sistemas de transduccin de seal son muy importantes porque de ellos depende gran parte del control de la expresin gnica y porque son manipulables genticamente de forma que podemos utilizarlos para disparar procesos de expresin gnica usando seales inductoras diferentes de las que normalmente las controlan en la naturaleza pero que son poco manejables eh procesos industriales biotecnolgicos. 3.- Requerimientos estructurales para la exportacin de protenas Si se desea utilizar el potencial de los microorganismos como productores de protenas en la industria es necesario, adems de proceder al clonaje de los genes codificantes de las protenas de inters y de estudiar y manipular el control de la expresin de los gen es correspondientes, conocer cmo se puede lograr que la protena se localice en una fraccin del cultivo donde sea ms fcil proceder a su purificacin. En la mayora de los casos es interesante que la protena se exporte al exterior de la clula y para ello hay que conocer el mecanismo por el que esto ocurre.

Las protenas sintetizadas en las clulas estn destinadas, como norma, a quedarse en el citoplasma celular. Para que una protena se integre en la membrana celular o para que la atraviese y sea exportada al exterior, es necesario que la protena contenga unas seales que dirijan este proceso. Estas seales son componentes de l a secuencia de aminocidos de la propia protena que se localizan en el extremo amino-terminal (el primero que se sintetiza por el ribosoma) del pptido naciente. Existen varios tipos de seales: unas son las seales de exportacin que sirven para que el pptido que va sintetizndose sea exportado al exterior de la membrana citoplsmica. Estas seales son secuencias que se insertan y atraviesan la membrana plasmtica y, una vez que se ha conseguido el paso del pptido naciente al exterior celular, son eliminadas mediante una enzima denominada peptidasa seal (signal peptidase, en ingls). Si no funciona la peptidasa seal, la protena queda unida por su extremo aminoterminal a la membrana citoplsmica. Otro tipo de seales sirven para que la protena se ancle en la membrana celular: son secuencias que estn diseadas para quedarse atrapadas en la bicapa lipdica de la membrana celular de manera que las protenas que las contienen pasan a ser protenas integrales de membrana y no pueden purificarse con mtodos convencionales. Por ltimo, en los organismos eucariticos (y por ello en hongos y levaduras de inters biotecnolgico) se puede producir otro procesamiento adicional de las protenas: la glicosilacin, consisten te en la adicin ordenada de cadenas polisacardicas a los pptidos nacientes. La presencia de estas modificaciones polisacardicas es esencial para la funcin de muchas protenas eucariticas. La adicin de las cadenas de azcar se produce en el Aparato de Golgi y tiene lugar en protenas que contienen una secuencia dos tipos de seales: una que las dirige hacia dicho orgnulo celular (especializado en modificacin de las protenas y su posterior secrecin al medio extracelular) y una segunda seal que indica en qu posiciones de la secuencia de la protena va a producirse la unin del polisacrido. 4.- Conclusin Desde el punto de vista biolgico, la expresin de la informacin gen tica de un organismo y su transmisin entre generaciones es un proceso complejo en el que interviene un gran nmero de protenas y de mecanismos. Estos mecanismos aseguran la fidelidad de la copia de la informacin desde el ADN al ARN para asegurar la expresin, y del ADN a una nueva molcula de ADN para asegurar la transmisin. Sin embargo, adems de la traduccin del ARN por los ribosomas, para que se produzca una correcta expresin del mensaje gentico ha de estar controlado el momento del dicha expresin, ha de asegurarse que el mensaje (protena) adquiera la conformacin correcta para su funcionamiento y se coloque en el lugar celular correspondiente. Desde el punto de vista biotecnolgico, todos estos procesos son manipulables para poder conseguir la expresin artificial de protenas de inters industrial en procesos llevados a cabo por microorganismos.

Microbiologa Aplicada al Tratamiento de residuos slidos urbanos

1.- Introduccin. Los residuos slidos urbanos (RSU, o en ingls Municipal Solid Waste, MSW) es un tipo de contaminacin muy heterogneo en composicin (madera, tela, plstico, metal, restos de alimentos, papel, etc.) muy concentrada en su produccin (los grandes ncleos urbanos producen ms RSU que los puebles pequeos) y a la que contribuimos todos de forma significativa. La composicin de los RSU vara histricamente, estacionalmente y segn el nivel econmico del ncleo urbano que los produce. 2.- Tratamiento de los RSU. Las soluciones para el tratamiento de los RSU son variadas: (1) La ms clsica es el vertedero en el que no se selecciona el material. Este procedimiento ha venido siendo poco costoso econmicamente aunque no ecolgicamente. Actualmente plantea dos problemas: (a) no existe seguridad de que no se produzcan filtraciones del material vertido a las aguas subterrneas; (b) es muy difcil encontrar nuevos emplazamientos para los vertederos cerca de los ncleos urbanos, lo que incrementa el coste del vertido. La tendencia actual es hacia la reduccin del nmero y la capacidad total de los vertederos; aunque seguirn existiendo como vertederos selectivos para el material biolgicamente inactivo que no sea recuperable mediante reciclaje o compostaje. (2) Incineracin que presenta problemas econmicos (las instalaciones son muy costosas) y ecolgicos (problemas relacionados con la seguridad y toxicidad de los humos y cenizas). Sin embargo, la incineracin permite una gran reduccin del volumen (85%) y del peso (75%) del material destinado a los vertederos. (3) Reciclado y compostaje. El reciclado consiste en la de restos de papel, metal o cristal en materias primas para nuevos productos en los que no cambia el material (el papel se convierte en nuevo papel). Compostaje es el proceso en el que los residuos no reciclables pero biodegradables se convierten por un proceso microbiolgico en residuos orgnicos estables con menos peso y volumen, inocuos desde el punto de vista sanitario, fcilmente transportables y almacenables y tiles como aditivos en el tratamiento de suelos. En los pases ms avanzados el tratamiento de los RSU comprende dos etapas: (1) La incentivacin para la reduccin del volumen e impacto ambiental de los productos iniciales (reduccin de los envoltorios, substitucin por materiales biodegradables, utilizacin de productos concentrados que requieren menos volumen para empaquetar, utilizacin de pilas de carbono-zinc menos contaminantes, etc.)

(2) El tratamiento por reciclaje y compostaje de aqul material susceptible, preferentemente a su incineracin o vertido, siendo considerados estos dos ltimos como mtodos viables complementarios de los primeros dependiendo de cada caso particular. Para un tratamiento correcto de los RSU es necesaria su clasificacin por los consumidores (que son sus principales generadores) mediante la separacin de los residuos siguiendo una de dos estrategias alternativas: (1) Histricamente se ha prestado ms atencin al reciclado por lo que la separacin de los residuos en dos fracciones se haca en reciclable/no reciclable ms compostable. (2) Alternativamente se puede hacer la clasificacin en base al compostaje en dos fracciones: compostable y no compostable ms reciclable. Esta ltima alternativa permite un compostaje (obtener un compost) de ms calidad que en el caso anterior puesto que la separacin de los residuos no compostables se realiza por el consumidor y, por lo tanto, se realiza en el origen. La separacin del material reciclable del no reciclable, en este caso, se hace en la factora de tratamiento de los RSU. La factora (Planta) de tratamiento de los RSU ha de realizar en cualquiera de los dos casos, una clasificacin final de los residuos, y un tratamiento inicial previo al compostaje que suele consistir en la disgregacin y fractura del material en trozos pequeos y en humedecerlo para que tenga la cantidad de agua adecuada para el proceso microbiolgico. 2.- Compostaje. 2.1.- Definicin. El compostaje es un proceso de fermentacin slida espontnea basado en el aumento de la temperatura producido por la actividad de los microorganismos. El material a comportar es el medio de cultivo, la fuente de nutrientes, el inculo, la fuente de agua y el producto final. El propio material retiene el calor producido por los microorganismos y esto causa el aumento en la temperatura del proceso. Para esto es necesario que la cantidad de material a comportar supere un mnimo crtico. 2.2.- Generacin de calor durante el compostaje. El aumento de la temperatura durante el proceso de compostaje se debe al catabolismo aerobio del material compostable por los microorganismos que forman su flora natural. Como consecuencia de este metabolismo aerobio se utilizan los carbohidratos, lpidos y protenas del substrato como fuente de carbono y de energa por los microorganismos quimioheterotrofos; estos mutrientes son metabolizados por rutas diferentes que convergen en ciclos productores de gran cantidad de energa (ciclo de Krebs o de los cidos tricarboxlicos) tanto directamente utilizable (una molcula de ATP por ciclo completo) como obtenible mediante la cadena transportadora de electrones (cadena respiratoria, 2 molculas de NADH+H+, una de NADPH+H+ y una de FADH2 por vuelta de ciclo). Parte de esta energa la disipan los microorganismos como calor, necesario para elevar la temperatura ambiental de forma que

puedan funcionar metablicamente de forma ms eficiente. Cuando, debido al apilamiento de material compostable, parte del calor producido queda atrapado en el mismo material en proceso de compostaje, se produce un efecto de retroalimentacin de la generacin de calor. Por consiguiente, para la generacin de calor es necesario el metabolismo aerobio que permita convertir las molculas de nucletidos reducidos (NADH+H+, NADPH+H+ y FADH2) en molculas utilizables metablicamente como unidades de energa (ATP), y esto slo es posible mediante la cadena transportadora de electrones con el O2 como aceptor final (cadena respiratoria). En caso de no existir suficiente oxgeno para permitir el metabolismo aerobio, los microorganismos cambian su tipo de produccin de energa hacia procesos fermentativos mucho menos eficientes desde el punto de vista energtico (menos produccin de calor, procesos ms lentos), que generan productos secundarios que, en ciertas ocasiones, pueden resultar indeseables (generacin de metano, malos olores producidos por poliaminas, etc.), que no esterilizan el material (no sube la temperatura y no se produce la autoesterilizacin) por lo que sanitariamente el producto puede ser peligroso y que no logran la estabilizacin biolgica total del producto (esto es: productos de fermentaciones anaerobias pueden ser utilizados como fuentes de carbono y energa por otros quimioheterotrofos posteriormente). 2.3.- Ejemplo de proceso de compostaje. El proceso de compostaje puede ejemplificarse con el tratamiento de las hojas producidas en otoo: al caer las hojas estn cubiertas por muchos microorganismos. Por separado no muestran variaciones de temperatura como resultado del metabolismo microbiano; pero si se apilan para que contengan la temperatura, sta sube y se produce un proceso de seleccin de los microorganismos: (1) Las bacterias y hongos mesfilos, mediante un proceso de retroalimentacin positiva incrementan su nmero y la temperatura hasta que sta se hace limitante y mueren (hacia 45C55C); (2) A esta temperatura los microorganismos ms importantes son los termfilos que, mediante un segundo proceso de retroalimentacin positiva-neutra-negativa, incrementan nmero y temperatura hasta alcanzar los 80C; (3) A esta temperatura se produce un cierto proceso de autoesterilizacin del producto y la temperatura desciende progresiva e irreversiblemente. Si el material de partida est muy compactado o con mucha humedad, no se puede producir un intercambio efectivo de oxgeno y se desarrollan procesos fermentativos que retrasan o impiden el aumento de temperatura. El proceso espontneo de compostaje es relativamente lento debido al efecto inhibidor de la alta temperatura y a la disminucin del oxgeno interno. Esto no es importante para procesos pequeos; pero es muy problemtico en los procesos industriales debido al incremento del coste que supone. 2.4.-Manipulacin del proceso de compostaje.

Industrialmente es necesario agilizar el proceso de compostaje para que se produzca totalmente con la mxima rapidez. Para esto hay que manipular las variables del proceso de fermentacin para conseguir las condiciones ptimas para el proceso. Los aspectos manipulables del proceso son el tamao y la forma de la pila de compostaje, la agitacin mecnica del material y la ventilacin del proceso. Vamos a estudiar varios casos en los que se alteran estas variables para estudiar su efecto en la velocidad del proceso. (1) Efecto del tamao y forma de la pila. Como ejemplo estudiaremos con ms detalle el compostaje urbano de las hojas de rboles. Este material se produce slo durante un periodo concreto del ao (dos meses en otoo) lo que permite disponer de nueve meses para su procesado y, por consiguiente, un compostaje lento. El diseo de la pila ha de hacerse en funcin de los requerimientos del proceso y de las condiciones ambientales: (a) al inicio es necesario una buena aireacin del material para que se inicie el proceso de incremento de la temperatura evitando la anoxia; al mismo tiempo, es necesario evitar un excesivo incremento de la temperatura en esta primera etapa que conduzca a una autoesterilizacin del material antes de que sea biolgicamente estable. Por consiguiente, esta primera pila ser de dimensiones reducidas. (b) En invierno, el descenso acusado de la temperatura ambiental hace de este el factor limitante que hay que prevenir, y esto se logra combinando dos pilas de compostaje de otoo en una mayor de invierno. (c) En primavera es necesario, de nuevo, prevenir la anoxia por lo que el cultivo es agitado mecnicamente al principio de la estacin permitiendo su evolucin espontnea a continuacin. Este tipo de tratamiento no permite el co-compostaje de hojas con csped o con otro material putrescible o con otro ritmo de produccin. El co-compostaje es factible en pequeas instalaciones individuales; pero no en las industriales. (2) Agitacin mecnica. Si se agita peridicamente el material conpostando para obtener un control de la temperatura y un aumento del nivel interno de oxgeno puede comprobarse que el proceso mecnico no supone una reduccin de la temperatura significativa (45C-55C-79C a las 0, 10 y 35 horas tras la agitacin) mientras que los niveles de oxgeno no se hacen limitantes durante un periodo en el que la temperatura lo es (20%, 2,5%, 10% durante el mismo periodo, indicando el ltimo incremento el resultado de la autoesterilizacin del cultivo). Por consiguiente, la agitacin mecnica no es un procedimiento realista de control de la temperatura durante el proceso de compostaje, y no tiene un efecto significativo sobre la disponibilidad de oxgeno. Tiempo 0 h Temperatura 45C Oxgeno 20%

10 h 35 h

55C 79C

2.5% 10%

La tabla indica la variacin de la temperatura y del porcentaje de oxgeno en la masa en fermentacin a diferentes tiempos (medidos en horas) despus de un volteo mecnico. El aumento de la cantidad de oxgeno a las 35h se debe al proceso de autoesterilizacin por alta tempetratura que detiene su consumo por los microorganismos presentes en la mezcla. (3) Ventilacin. La ventilacin forzada de la pila de compostaje permite proporcionar oxgeno, eliminar CO 2 y descender la temperatura del proceso. La mayor parte del calor que se genera procede de la respiracin aerobia de los microorganismos, y este calor se emplea, en su mayor parte (80%), en la vaporizacin del agua, de forma que es necesario mucho ms aire para eliminar el calor generado que para proporcionar el O2 necesario (relacin 9:1). El calor eliminado por ventilacin puede calcularse como

Qv=m * (h(salida) h(entrada))

Donde

m es el flujo de aire (masa por unidad de tiempo), h(entrada) es la entalpa del aire de entrada (energa por unidad de masa de aire), h(salida) entalpia del la del aire de salida Qv la energa por unidad de tiempo eliminada.

Los valores de h dependen de la humedad relativa del aire que en salida es del orden del 100%. Los valores de Qv vienen limitados por las condiciones biolgicas de los microorganismos. 3.1.- Procesos basados en el flujo libre de aire 3.1.1- Cuando la ventilacin se disea para proporcionar O2 se hace pasar aire a travs de la pila controlando el flujo con un programador de tiempo que est activo durante poco tiempo y es capaz de mover decenas de metros cbicos de aire seco por tonelada y hora de material. En estas condiciones, para mantener una concentracin de O2 del orden del 10-15% el flujo de aire necesario (m) es demasiado pequeo para evitar que se produzca el suicidio por elevacin de la temperatura de la poblacin microbiana. Esto enlentece excesivamente la duracin del compostaje. 3.1.2.- La ventilacin puede disearse para controlar simultneamente la temperatura (la adecuada biolgicamente es del orden de 60C) y la oxigenacin del proceso. En este caso, el regulador de la ventilacin est controlado inicialmente por tiempo hasta llegar a una temperatura determinada, momento en el que la ventilacin pasa a ser controlada para mantener la temperatura del proceso. En este caso, es necesario hacer frente a los picos de temperatura

mediante la inoculacin de un alto flujo de aire (centenares de metros cbicos por tonelada y hora). Cuando el proceso de compostaje est completo, la temperatura comienza a descender y el control vuelve a ser temporal. Durante todo el proceso el nivel de oxgeno es alto debido a la relacin 9:1 por lo que el aporte de O2 es ms que suficiente. El mayor inconveniente de este sistema es que se produce un gradiente de temperatura muy acusado entre la parte inferior y la superior de la pila de compostaje, lo que genera diferencias en la velocidad del proceso y, finalmente, una desecacin del material que puede comprometer la velocidad de crecimiento de los microorganismos. De hecho, como la humedad generada deriva nicamente del calor producido por la actividad biolgica, una manera de seguir el proceso de compostaje es el seguimiento de la humedad del aire de salida. 3.2.- Procesos basados en la recirculacin de aire. El proceso denominado de tnel holands se utiliza para producir compost destinado a la produccin de champin. consiste en la construccin de pilas de 3x3x33m cerradas en salas especiales. El suelo es falso y permite que se insufle el aire desde la parte inferior del compost, este aire sale por la parte superior y es recogido en la bveda de la cmara. El aire se hace recircular pasando bien por un compresor que lo refrigera y descarga de humedad o bien directamente a la parte inferior de la cmara; la eleccin de uno u otro circuito depende de la necesidad de humedad de la mezcla. Se permite la entrada de aire nuevo del exterior dependiendo de la necesidad de oxgeno para el proceso, el volumen de aire del exterior que entra es compensado por liberacin al exterior de aire del circuito. Con este sistema se puede lograr, mediante un control computerizado del proceso, que no se genere un gran gradiente de temperatura en la cmara de fermentacin, lo que hace que el proceso, y el producto final, sea ms homogneo. As mismo, permite un control muy fino de la temperatura y de la humedad. El sistema requiere menos consumo de aire ambiental y un aislamiento de una zona ms pequea que en los casos anteriores, lo que facilita la ventilacin de las instalaciones y el manejo de los gases de salida. 4.- Bibliografa: Finstein, M.S. 1992. Composting in the control of municipal solid waste management. En Environmental microbiology Ed. por R. Mitchell. Wiley-Liss. New York. pp. 355-374.

Principios y microbiologa del tratamiento de aguas residuales

Introduccin. Composicin de las aguas residuales domsticas. Demanda biolgica de oxgeno. Demanda qumica de oxgeno. Carbono orgnico total. Pasos del tratamiento de aguas residuales. Procesos de lodos activados. Descripcin del sistema bsico. Microorganismos presentes en los flculos. Aspectos nutricionales del proceso. Digestin anaerobia de aguas residuales 1.- Introduccin. El tratamiento de aguas residuales se inici en Inglaterra a finales del siglo XIX y principios del XX para controlar los brotes infecciosos en las ciudades. Histricamente, el primer objetivo del tratamiento de aguas era reducir el contenido en materia en suspensin del agua a menos de 30 mgl-1 y la demanda biolgica de oxgeno (ver ms adelante) a menos de 20 mgl-1. La aguas a tratar pueden ser domsticas (compuestas de aguas negras, restos de alimentos, patgenos y parsitos), y aguas industriales (contaminadas principalmente por compuestos xenobiticos y metales pesados). Los objetivos del tratamiento biolgico son tres: (1) reducir el contenido en materia orgnica de las aguas, (2) reducir su contenido en nutrientes, y (3) eliminar los patgenos y parsitos. 2.- Composicin de las aguas residuales domsticas. Estn contaminadas con materia orgnica fcilmente biodegradable (40-60% de protenas, 2550% de carbohidratos y 10% de lpidos, con trazas de otros compuestos). La materia orgnica puede encontrarse como carbono disuelto (Carbono Orgnico Disuelto, COD) o en forma particulada (Carbono Orgnico Particulado, COP). Este ltimo puede separarse del disuelto por decantacin o por floculacin. Existen tres mtodos principales para medir la cantidad de materia orgnica en el agua: (1) la medida de la demanda biolgica de oxgeno (2) la de la cantidad total de carbono (3) la de la demanda qumica de oxgeno. Todos los mtodos se basan en la valoracin de la cantidad de oxgeno necesaria para oxidar diferentes fracciones de la materia orgnica presente en el agua. 2.1.- Demanda biolgica de oxgeno: (DBO), Se define como la concentracin de oxigeno disuelto consumido por los microorganismos, presentes en el agua o aadidos a ella para efectuar la medida de este parmetro, en la oxidacin de toda la materia orgnica presente en la muestra de agua. Su valor debe ser inferior a 8 mgl -1. La DBO puede descomponerse en dos factores: (1) La demanda de oxgeno para la oxidacin realizada por los microorganismos quimioheterotrofos o Demanda Hidrogenada o Hidrogenosa de Oxigeno (DOH)

(2) El oxgeno consumido en las oxidaciones de los quimioautotrofos nitrificantes (bacterias que oxidan el NH4 para obtener energa o Demanda Nitrogenada de Oxigeno, DON). La DOH se mide aadiendo la muestra de agua a analizar a una solucin tampn que contiene las sales inorgnicas necesarias para el crecimiento de los microorganismos y que est saturada de O2. La muestra se incuba en estas condiciones durante cinco das a 20C en la obscuridad. Las concentraciones de oxgeno se miden utilizando un electrodo de oxgeno. Es necesario aadir al experimento un inhibidor de la nitrificacin (ver ms adelante). El clculo de la DOH se hace segn la frmula: DOH (mgl-1) = (D1-D5)/P Donde: D1 y D5 son las concentraciones de oxgeno en la muestra el primero y el quinto da P el coeficiente de dilucin de la muestra.

Para realizar esta medida se necesita una poblacin mixta de microorganismos; si esta no es muy abundante puede suplementarse con un inculo destinado a la degradacin del material orgnico en el tiempo requerido. El valor de la DOH comprende todas las transformaciones oxidativas de la materia orgnica biodegradable: Comp. Orgnicos + O2 + bacterias biomasa bacteriana + CO2 + NH4 + H2O Biomasa bacteriana + O2 + protozoos biomasa de protozoos + CO2 El rendimiento de la conversin de la biomasa bacteriana en la de protozoos es de 0,78 mg protozoos / mg bacterias. La DON es la cantidad de oxgeno consumida por los microorganismos nitrificantes que oxidan el NH4 como fuente de energa. En general, el consumo viene a ser de unos 4.57 gr O 2 por gr de NH4 consumido; pero parte de este nitrgeno no se oxida a NO 2- o a NO3- sino que se incorpora a las bacterias, por lo que el factor de correccin para los clculos es de 4.33: DON = (Ndisponible - Nasimilado) * 4.33 La DON es la causante de muchos altos valores de demanda de oxgeno en aguas con bajo contenido de materia orgnica: en aguas ricas en NH4 la actividad de las bacterias nitrificantes puede consumir entre el 25 y el 85% del total del oxgeno consumido. Para distinguir entre la DOH y la DON se emplean inhibidores de la nitrificacin que no afectan al consumo hetertrofo de materia orgnica. Un inhibidor de este tipo de la 2-cloro-6(tricloro-metil)-piridina. 2.2.- Demanda qumica de oxgeno (DQO): (DQO) es la cantidad de oxgeno requerida para oxidar completamente la materia orgnica utilizando oxidantes qumicos como el dicromato potsico (K2Cr2O7) con cido sulfrico. Los

valores de la DQO han de estar en relacin con los de la DBO; si la DQO es mucho mayor que la DBO una parte importante de la materia orgnica presente en el agua no ser fcilmente biodegradable. Para las aguas domsticas, la DQO es del orden de 250 a 1000 mg O 2 por litro, y la relacin DBO/DQO oscila entre 0.4 y 0.8. Las aguas estabilizadas biolgicamente tienen una relacin DBO/DQO = 0.12. (Ver tratabilidad de las ARD) 2.3.- Carbono orgnico total: (COT) Se mide mediante la oxidacin de la materia orgnica aplicando calor y oxgeno o mediante oxidantes qumicos y se detecta mediante anlisis infrarrojo de la produccin de CO2. Los valores deben ser comparables con los de la DQO. 3.- Pasos del tratamiento de aguas residuales En el tratamiento de aguas residuales se pueden distinguir hasta cuatro etapas que comprenden procesos qumicos, fsicos y biolgicos: (1) Tratamiento preliminar, destinado a la eliminacin de residuos fcilmente separables. (2) Tratamiento primario que comprende procesos de sedimentacin. (3) Tratamiento secundario que comprende procesos biolgicos (lodos activados) y qumicos (desinfeccin) (4) Tratamiento terciario o avanzado que est dirigido a la reduccin final de la DBO, la disminucin de nutrientes y la eliminacin de patgenos y parsitos. 4.- Procesos de lodos activados 4.1.- Descripcin del sistema bsico: Tratamiento iniciado en Inglaterra a principios de este siglo y que se ha difundido mucho. Consiste en un tratamiento aerobio que oxida la materia orgnica a CO2 y agua y NH4+ y nueva biomasa. El aire necesario para el tratamiento se proporciona mediante difusin o por tratamiento mecnico. Durante el tratamiento los microorganismos forman flculos que, posteriormente, se dejan sedimentar en un tanque ad hoc denominado tanque de clarificacin. El sistema bsico comprende, pues, un tanque de aireacin y un tanque de clarificacin por los que se hace pasar los lodos varias veces. Los dos objetivos principales del sistema de lodos activados son (1) La oxidacin de la materia biodegradable en el tanque de aireacin (2) La floculacin que permite la separacin de la biomasa nueva del efluente tratado. 4.2.- Microorganismos presentes en los flculos: Los flculos de lodo activado contienen partculas orgnicas, inorgnicas y bacterias. El tamao de las partculas vara entre 1 m y 1000 m. Las clulas vivas del flculo representan entre el 5 y el 20% del total de bacterias. Los microorganismos presentes en los flculos son bacterias, hongos, protozoos y rotferos.

(1) Bacterias: Constituyen el principal componente. Los gneros principales son Zooglea, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Achromobacter, Corynebacterium y Acinetobacter; tambin hay formas filamentosas como Beggiatoa. Estas bacterias oxidan la materia orgnica y producen polisacrtidos y otros polmeros extracelulares que facilitan la floculacin. Los microorganismos aerobios representan una fraccin importante cuyo nmero vara inversamente al tamao del flculo puesto que la difusin de O2 al interior se va viendo ms dificultada. En los flculos de gran tamao el interior es anaerobio y permite el crecimiento de anaerobios estrictos (tales como metangenos) que han sobrevivido fases de mayor aerobiosis en pequeas bolsas anaerobias internas en flculos de menor tamao. Su nmero en los lodos activados llega a 10 8 ufcml-1 y entre ellas el grupo ms importante numricamente es el de Pseudomonas. En los lodos activados tambin hay bacterias autotrofas tales como las nitrificantes (Nitrosomonas y Nitrobacter responsables de la DON) e incluso algunas bacterias fotosintticas. (2) Hongos: Normalmente no estn presentes. Slo en condiciones ambientales muy especiales (bajo pH, deficiencia de nitrgeno, presencia de productos txicos) pueden apaercer ciertos hongos de los gneros Penicillium y Cephalosporium, entre otros. (3) Protozoos: Estn presentes como depredadores de las bacterias. Pertenecen a los tres grupos (ciliados, flagelados y rizpodos). La actividad de los protozoos contribuye significativamente a la reduccin de la DBO. (4) Rotferos: Son metazoos de tamao entre 100 y 500 m. Son organismos que se unen al flculo y desarrollan dos importantes funciones en l: (a) Eliminan las bacterias libres que no se han agregado al flculo, y (b) Contribuyen a la formacin del flculo mediante la produccin de materia fecal rodeada de capas de mucus. 4.3.- Aspectos nutricionales del proceso: Las aguas residuales domsticas tienen una relacin C: N: P de 100:5:1 lo que satisface las necesidades nutritivas de muchos microorganismos que digieren la matera orgnica en pocas horas transformando la DBO en biomasa. La aireacin en este tanque permite (1) Mantener las condiciones de aerobiosis que dirigen el proceso (2) Mantener en suspensin los flculos para que puedan acceder a todo el volumen de lquido en tratamiento.

Cuando los microorganismos han reducido la cantidad de nutrientes de forma significativa entran en una fase metablica similar a la estacionaria y en ella producen gran cantidad de polmeros extracelulares (por ejemplo Zooglea) que permiten la agregacin del material del flculo. Los heteropolisacridos que forman el ncleo del flculo son refractarios a la biodegradacin. 5.- Digestin anaerobia de aguas residuales Consiste en una serie de procesos microbiolgicos dirigidos a la digestin de la materia orgnica con produccin de metano. Es un proceso en el que pueden intervenir diferentes tipos de microorganismos pero que est dirigido principalmente por bacterias. Presenta una serie de ventajas frente a la digestin aerobia: (1) muchas bacterias anaerobias pueden usar CO2 como aceptor de electrones y, por tanto, no hay necesidad de suministrar oxgeno por lo que el proceso es ms barato. (2) Se produce menos cantidad de lodo porque la eficiencia energtica de las bacterias anaerobias es menor: el 50% del carbono es convertido en biomasa en condiciones aerobias y slo el 5% en condiciones anaerobias. (3) Se produce un gas til. (4) El requerimiento energtico es menor (5) Se pueden degradar compuestos xenobiticos ambientales de gran poder deletereo. Sin embargo, se pueden citar algunos inconvenientes: (1) Es un proceso lento, (2) Muy sensible a agentes txicos.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras. 1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u homogeneizadas). - Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. - Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales. Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso. Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:. Contaje en Placa Estndar (Del ingles Standard Plate Count). Determinacin del nmero ms probable. Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables. Contaje microscpico directo.

1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra. 2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica de epifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran

para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. 6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. 8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas. 2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones.

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector. 3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido. C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin. E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos. 4. Mtodos inmunolgicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias)

A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido. E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli. F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos. 5. Examen de superficies. - Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos presentes en superficies contaminadas. Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico. Las muestras se recogen en seco o en hmedo y se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o de enriquecimiento). En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. 6. Recuento de mohos y levaduras. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos.