KROMATOGRAF

Kromatografi, bir karmda bulunan maddelerin, biri sabit dieri hareketli faz olmak zere birbirleriyle karmayan iki fazl bir sistemde ayrlmas ve saflatrlmas yntemidir.

KROMATOGRAF
lk kez Rus botaniki Mikhail Tsvett (1903) tarafndan gelitirilen bir yntemdir. Tsvett bu yntemi bitki pigmentlerinin renkli bileenlerini ayrmakta kullanlmtr. Kulland kolonda renkli bandlar olutuundan, bu ayrma yntemine kromatografi adn vermiti

KROMATOGRAF
Bir para kat eridin aa hizasndan 1 cm kadar yukarsna bir damla siyah mrekkep damlatnz. Kat eridi, mrekkep damlattnz ksm su hizasnn stnde kalacak ekilde su tankna batrnz ve dik bir ekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle kat zerinde yukar doru yrrken mrekkebi zer ve srklemeye balar. Mrekkebin iindeki bileenler kat zerinde farkl hzlarda ilerleyerek ayrlm olur.

KROMATOGRAF

KROMATOGRAF
Kromatografi, bir karmda bulunan maddelerin, biri sabit dieri hareketli faz olmak zere birbirleriyle karmayan iki fazl bir sistemde ayrlmas ve saflatrlmas yntemidir. eitli maddelerin hareketli faz yardmyla, sabit faz zerinde, deiik hzlarla hareket etmeleri veya srklenmeleri esasna dayanr.

Kromatografi nin Snflandrlmas

Ayrlma Mekanizmalarna Gre Uygulama Biimine Gre Faz Tiplerine Gre

Kromatografi nin Snflandrlmas

Ayrlma Mekanizmalarna Gre
Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi yon deitirme kromatografisi Jel filtrasyon (Molekler eleme) kromatografisi yon ifti kromatografisi Afinite kromatografisi

Kromatografi nin Snflandrlmas

Uygulama Biimine Gre
- Dzlemsel kromatografi Kat kromatografisi nce tabaka kromatografisi (TLC) - Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yksek basnl sv kromatografisi (HPLC)

Kromatografi nin Snflandrlmas

Faz Tiplerine Gre
- Sv kromatografisi Sv-Kat kromatografisi Sv-Sv kromatografisi - Gaz kromatografisi Gaz-Kat kromatografisi Gaz-Sv kromatografisi

Kromatografi nin Snflandrlmas

Ayrlma Mekanizmalarna Gre
Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi yon deitirme kromatografisi Jel filtrasyon (Molekler eleme) kromatografisi yon ifti kromatografisi Afinite kromatografisi

Ayrlma Mekanizmasna Gre

Adsorpsiyon Kromatografisi
Adsorpsiyon, bir karmda bulunan sv veya gaz halindeki maddelerin kat faz zerine tutunmasdr. Adsorpsiyon kromatografisi ise rnek bileenlerinin dolgu maddesinin yzeyinde farkl olarak tutunmalar sonucu meydana gelen bir ayrma ilemidir. Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler kat olan sabit faz ile sv veya gaz olan hareketli faz arasnda etkileir. Faz tiplerine gre adsorpsiyon kromatografisi sv-kat gaz-kat Sabit faz : Durgun veya hareketsiz fazdr kromatografisidir.

Hareketli faz : Sabit faz zerinde hareket ederek numune bileenlerinin ayrlmasn salayan fazdr

Ayrlma Mekanizmasna Gre

Adsorpsiyon Kromatografisi

Sabit faz Ayrlmas gereken maddeleri paralamamal Ayrlmas beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli Adsorpsiyon kapasitesi yksek olmal Adsorpladklar maddeleri kolaylkla geri vermeli

Ayrlma Mekanizmasna Gre

Dalma (Partisyon) Kromatografisi
Dalma kromatografisinde; maddeler sv olan sabit faz ile sv veya gaz olan hareketli faz arasnda dalr. Birbiriyle karmayan iki svdan, yani iki fazdan oluan bir faz sistemi iine konulan madde bu svlardaki znrlne bal olarak iki faz arasnda dalr ve dengeye ular. Byle bir sistemde maddelerin dalmas sabit olup dalma katsays ile ifade edilir ve Kd ile gsterilir. Bylece Kd deerleri birbirinden farkl olan maddeler kromatografik sistem iersinde farkl hzlarda ilerleyerek birbirlerinden ayrlrlar.

Kd = C1/C2

C1 : Maddenin 1. fazdaki deriimi C2 : Maddenin 2. fazdaki deriimi

Faz tiplerine gre partisyon kromatografisi sv - sv sv - gaz kromatografisidir.

Destek:Dalma kromatografisinde, sv sabit fazn adsorpland materyaldir.

Ayrlma Mekanizmasna Gre

yon Deitirme Kromatografisi
Maddelerin iyonik gruplar ile iyon deitiricideki iyonik gruplarn edeer miktarlarnn karlkl yer deitirmesi esasna dayanr.
yon deitirme kromatografisi, kullanlan iyon deitiricinin anyon veya katyon aktarmasna gre srasyla anyon deitirme kromatografisi veya katyon deitirme kromatografisi olarak adlandrlr. Cl- ve I- karmnn nitrat balanm anyon deitirici RNO3 ile bileenlerine ayrlmasnda geerli dengeler aadaki biimdedir:

Anyon Deitirici

ICl-

Cl- + RNO3 I+ RNO3

RCl + NO3RI + NO3-

R: znmeyen Matriks

RNO3 : Anyon Deitirici

Ayrlma Mekanizmasna Gre

yon Deitirme Kromatografisi

norganik iyon deitiriciler : Na2Al2Si4O12 Na2P Organik iyon deitiriciler: Anyonik, Katyonik ve Amfoter Reineler Ca2+ Fe2+ Mn2+ Mg2+

Ayrlma Mekanizmasna Gre

yon Deitirme Kromatografisi
Hareketli faz deriimi Hareketli faz pHs Kompleks oluturucu etki yon deitirme kromatografisinin uygulanmas
Ayrlmalar g olan baz iyonlar ve asitlerin Aminoasitler Seyreltik iyon zeltileri deritirmede Asit ve baz elde edilmesinde NaCl NaOH + Cl-

yon deitirmeyi etkileyen faktrler

Ayrlma Mekanizmasna Gre

Jel Filtrasyon (Molekler Eleme) Kromatografisi
Karmdaki molekllerin molekl byklklerinde gre ayrlmas esasna dayanr.

Ayrlma Mekanizmasna Gre

yon ifti Kromatografisi

Bu teknik, zellikle iyonlaabilen asidik veya bazik maddelerin ayrlmasnda kullanlr. Hareketli faza ilave edilen iyon ifti reaktif sabit faz tarafndan adsorplanr ve iyonize olmu maddeler bu iyon iftleri ile iyonik etkileime girerek birbirinden ayrlr.

Ayrlma Mekanizmasna Gre

Afinite Kromatografisi
Antijen Antikor Enzim Substrat Reseptr la gibi olduka dayanr. spesifik etkileimlere Seicilii fazla olan bu yntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir.

Kromatografi nin Snflandrlmas

Uygulama Biimine Gre
- Dzlemsel kromatografi Kat kromatografisi nce tabaka kromatografisi (TLC) - Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yksek basnl sv kromatografisi (HPLC)

Dzlemsel Kromatografi

Dzlemsel Kromatografi

UV Lambas

Kolon Kromatografisi

Kolon Kromatografisi
1903 ylnda Tsvet bitki pigmentleriyle alrken kolon dolgu maddesi olarak kire kullanmt. Gnmzde ise ounlukla silika jel ve alumina kullanlmaktadr.

Kolon Kromatografisi

Kolon Kromatografisi

Gaz Kromatografi (GC) Yksek Performansl Sv Kromatografi (HPLC)

Kolon Kromatografisi

Gaz Kromatografi (GC)

Yksek Basnl Sv Kromatografi (HPLC)

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

HPLC
Sv Kromatografisi: Sv kromatografisi dzlemsel yzeylere ve kolonlara uygulanabilen bir kromatografi trdr.

Normal Faz Sv Kromatografisi: Polar sabit faz ve apolar veya dk polariteye sahip hareketli faz Ters Faz Sv Kromatografisi: Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardr

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

HPLC
- Polar molekl - Apolar molekl

Tanecik
Kolon

Apolar faz Hareketli faz

Normal-faz Yksekten ortaya Ortadan de Apolar nce Ters-faz Ortadan de Yksekten ortaya Polar nce

Sabit Faz Polaritesi zc Polaritesi rnek k Yeri

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

HPLC Ters faz

C18 C8 C2

Normal faz

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Ters faz kromatografisinin avantajlar 1. Normal faz kromatografide, sv fazn kontrol ok nemli ve kritiktir. Hareketli faz bileimindeki kk deiiklikler kromatogramda belirgin farkllklara neden olabilir. 2. Dengeye ulama normal faz kromatografide ok yavatr. 3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elsyonu ok yavatr ve yayvan piklere sebep olur. 4. Apolar zcler ok pahaldr, ayrca nemden uzak tutmak zordur.

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Sv kromatografisi ynteminin zel bir uygulamas olan yksek performansl sv kromatografisi (HPLC) ynteminde, sabit faz olarak kullanlan dolgu maddelerinin tanecik boyutunun kltlmesi sonucu hareketli faz ile etkileen sabit faz yzey alan byr ve bylece kolonun etkinlii arttrlm olur. ok sk olarak doldurulmu kolondan hareketli fazn belirli bir hzla geebilmesi iin basn uygulanmas gerekir.

3 bar

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

HPLCnin avantajlar HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek ok kez kullanlabilir. HPLC teknii kullancnn becerisine daha az bamldr ve tekrarlanabilirlik daha yksektir. Nicel analiz kullanlabilir. Analiz sresi ksadr. Duyarlk yksektir.

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS HPLC Cihaz

Pompa
Hareketli faz rezervuar

Kolon Enjektr

Dedektr

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Kromatografide Temel Parametreler

Alkonma Zaman ve Alkonma Hacmi

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Kromatografide Temel Parametreler

Alkonma Zaman ve Alkonma Hacmi

tr1
Dedektr cevab

t0

Zaman veya Hacim

t0 = Hareketli fazn alkonma zaman tr = Alkonma zaman

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Kromatografide Temel Parametreler

Kapasite Faktr

Alkonma hacmi = VR = Vm + KVs

k' = (VR V0) / V0

k' = K Vs / Vm

Ak hz sabitse

tr t0 k = t 0 1 < k < 10

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS Kromatografide Temel Parametreler

Etkinlik

16 t r 5 . 55 t r = N = N= 2 2 2 w w1 2 tr

w1/2

1/2h t0

tr

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS Kromatografide Temel Parametreler

Seicilik
ki maddeye ait kapasite faktr oranna

= k'2 / k'1 = (tR2 t0) / (tR1 t0)

Seicilik, esas olarak sabit faz zelliklerine baldr ancak hareketli faz bileimi de seicilii etkiler.

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS Kromatografide Temel Parametreler

Ayrclk R=0.50 R=0.75

t0
R1

zaman

t0

zaman

R=1.00

R=1.50

t0

zaman

t0

zaman

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS Kromatografide Temel Parametreler

Ayrclk

R = 2 (t R2 t R1) / (w1 + w2)

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Nicel Analiz in HPLCde Kullanlan Kalibrasyon Teknikleri: Dorudan Kalibrasyon Teknii: Alan veya Pik Ykseklii

Deriim (ppm)

Alan

S1 S2 S3 S4

10 20 30 40

101 212 305 410

Cx

Deriim

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Nicel Analiz in HPLCde Kullanlan Kalibrasyon Teknikleri: Standart Teknii:

IS
Concentration

6 time

10

12

Yksek kesinlik elde edilir; nk bu metot ile numune enjeksiyonu, ak hz ve kolon artlarndaki deimelerle oluan belirsizlikler en aza indirilir.

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Nicel Analiz in HPLCde Kullanlan Kalibrasyon Teknikleri: Standart Teknii:
Deriim Derim 5 10 30 50 100 IS 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 Deriim oran 0,20 0,40 1,20 2,00 4,00 Numune 1881 4495 13430 25001 50141 Alan IS 16129 17126 15940 16846 16557 Alan oran 0,12 0,26 0,84 1,48 3,03

Bu metotta, standart ve numune zeltilerinin her birisine dikkatle llm miktarda bir i standart (IS) katlr.

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Nicel Analiz in HPLCde Kullanlan Kalibrasyon Teknikleri: Standart Teknii:
4 3 3 2 2 1 1 0 0 y = 0,0307x - 0,0515 R2 = 0,9998

Alan oran

20

40

60 Deriim

80

100

120

4 3 3 2 2 1 1 0 0

y = 0,7681x - 0,0515 R2 = 0,9998

Alan oran

2 Deriim oran

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS

Nicel Analiz in HPLCde Kullanlan Kalibrasyon Teknikleri: Standart Ekleme Teknii:

Alan 600 500 400 300 200 100 0 0 0,1 0,2

y = 980x + 152 R2 = 0,9996

0,3

0,4

0,5

Deriim (M)