Diah Ayu Putri K.

, Perdana Adhi Nugroho, Andita Pra Darma, Muthi Ikawati, Sugeng Riyanto, Edy Meiyanto

Potensi Kemopreventif Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Keprok (Citrus reticulata) pada Sel Kanker Hepar Tikus Galur Sprague Dawley Terinduksi 7,12-Dimetilbenz[]antrasena Melalui Penekanan Ekspresi c-Myc
Diah Ayu Putri K., Perdana Adhi Nugroho, Andita Pra Darma, Muthi Ikawati, Sugeng Riyanto, Edy Meiyanto*
Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta * Korespodensi : Dr. Edy Meiyanto, Msi., Apt. Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada e-mail: meiyan_e@yahoo.com URL : http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com

Abstrak
Senyawa flavonoid terutama metoksiflavon yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (Citrus reticulata) berpotensi sebagai alternatif pengobatan kanker hepar. Tangeretin dan nobiletin, dua senyawa metoksiflavon dari kulit jeruk keprok diperkirakan mampu menghambat protein kinase yang berperan penting dalam signal transduksi sel, misalnya c-Src yang berfungsi dalam aktivasi ekspresi c-Myc. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak etanolik kulit jeruk keprok terhadap penekanan ekspresi c-Myc pada tikus galur Sprague Dawley terinduksi 7,12dimetilbenz[a]antrasena (DMBA) dan potensi tangeretin dan nobiletin sebagai inhibitor c-Src dengan metode komputasi. Ekstrak etanolik kulit jeruk keprok yang disuspensikan dalam CMC-Na 0.5% dipejankan peroral pada tikus betina galur Sprague Dawley terinduksi DMBA. Pengamatan ekspresi protein c-Myc dilakukan dengan menggunakan uji imunohistokimia. Docking molekuler dilakukan dengan menggunakan program Molecular Operating Environment (MOE). Uji imunohistokimia menunjukan bahwa pemberian ekstrak etanolik kulit jeruk keprok mampu menurunkan ekspresi c-Myc. Tangeretin dan nobiletin mampu berinteraksi dengan protein c-Src meski dengan energi yang lebih besar dari ligan pembanding imatinib. Dari penelitian tersebut diambil kesimpulan bahwa ekstrak etanolik kulit jeruk keprok mampu menekan ekspresi c-Myc dengan kemungkinan mekanisme penghambatan signal transduksi c-Src. Kata kunci: jeruk keprok (Citrus reticulata), c-Src, kemopreventif, c-Myc

Pendahuluan Kanker hepar merupakan penyakit kanker yang mempunyai insidensi terbesar kelima di dunia, dengan insidensi pada pria lebih tinggi dibandingkan pada wanita (2-4:1). Jumlah kematian di dunia yang disebabkan oleh kanker hepar menunjukkan lebih dari satu juta jumlah kematian per tahun. Di Amerika Serikat, lebih dari 12.000 jumlah

kematian pertahun terkait dengan kanker hepar (Thuluvath et al., 2006). Penyebab kanker hepar secara umum adalah infeksi virus hepatitis B dan C, cemaran aflatoksin B1, sirosis hati, infeksi parasit, alkohol serta faktor keturunan (Fong, 2002). Studi kinetik kanker menemukan adanya berbagai jenis onkogen yang berperan dalam karsinogenesis di hepar. Overekspresi

Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008

Potensi Kemopreventif Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Keprok

c-Myc oleh senyawa karsinogen merupakan abnormalitas genetik yang sering terjadi pada kanker (Peters dan Vousden, 1997). Flavonoid mempunyai kemampuan untuk memodulasi metabolisme xenobiotic (Zhai et al., 1998). Penelitian lain menyebutkan pada tahap promosi kanker, metoksi flavon memiliki potensi jauh lebih besar dalam menghambat proliferasi sel kanker dibandingkan flavon yang tidak termetilasi (Walle, 2007). Oleh karena itu, senyawa flavonoid diperkirakan dapat menghambat overekspresi c-Myc. Senyawa flavonoid terutama metoksi flavon yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit Citrus reticulata sangat potensial sebagai agen kemopreventif dan alternatif pengobatan kanker hepar. Flavonoid dominan yang terdapat pada ekstrak kulit jeruk adalah tangeritin yang merupakan suatu senyawa metoksi flavon (Mitchell, 1998). Tangeretin yang terdapat pada kulit buah jeruk dapat meningkatkan ikatan antar sel dan menghambat proliferasi pada sel kanker payudara MCF-7/6 secara in vitro (Brack et al., 2002). Tangeretin dan nobiletin terbukti menginduksi G1 cell cycle arrest pada kanker kolon dan payudara dengan cara inhibisi pada target cdk4 dan cdk2 (Pan et al., 2002). Berdasarkan data-data tersebut, terlihat bahwa senyawa metoksi flavon (tangeretin dan nobiletin) memiliki kemampuan dalam menginhibisi protein kinase yaitu cdk2. Oleh karena itu senyawaan metoksi flavon yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit C. reticulata diperkirakan dapat menghambat protein kinase lainnya yang berperan penting dalam signal transduksi sel seperti c-Src yang berfungsi dalam aktivasi expresi c-Myc. Melalui penelitian ini akan dibuktikan khasiat ekstrak etanolik kulit jeruk keprok sebagai agen kemopreventif melalui penghambatan ekspresi protein c-Myc pada sel hepar tikus terinduksi DMBA. Selain menggunakan uji in vivo juga dilakukan eksperimen menggunakan uji komputasi yaitu menggunakan docking molekuler. Hasil dari docking ini dapat digunakan sebagai dasar untuk mengetahui selektivitas senyawa yang terkandung dalam tanaman tersebut sebagai agen kemopreventif.

Metodologi
Bahan Bahan tanaman dan preparasi ekstrak

Kulit jeruk keprok yang diambil dari daerah Kali Soro, Tawangmangu, Jawa Tengah dan telah dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi, Fakultas Farmasi UGM, dikeringkan dibawah sinar matahari dengan ditutupi kain hitam, diserbuk dengan blender hingga didapat serbuk kering. Dari 1 kg serbuk kulit jeruk keprok dimaserasi dengan etanol 70% selama 5 hari. Fraksi etanol yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental.
Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang berumur 40 hari dengan berat badan 70120 gram yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan, Universitas Gadjah Mada.
Docking Molekuler

Senyawa aktif ekstrak kulit jeruk keprok (tangeretin dan nobiletin) dirangkai dan dioptimasi dengan program MOE (Molecular Operating Environment) lisensi Fakultas Farmasi UGM. Ligan eksperimental yang digunakan adalah imatinib sedangkan protein target c-Src di-download dari situs: http/www/pdbbeta.rscb.org/pdb.
Cara Penelitian Uji in vivo

Hewan uji yang telah diadaptasikan di kandang percobaan selama 3 hari di bagi menjadi 5 kelompok, masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus. Kelompok I yaitu kelompok perlakuan DMBA, diinduksi DMBA dalam corn oil dengan dosis 20 mg/kgBB peroral 2 kali tiap minggu selama 5 minggu. Kelompok II-III, yaitu kelompok DMBA+dosis (750 dan 1500 mg/kgBB), diberi ekstrak etanolik kulit jeruk keprok setiap hari selama 10 hari selama inisiasi (minggu ke 3 setelah perlakuan DMBA). Dosis, cara dan frekuensi pemberian DMBA sama dengan kelompok perlakuan DMBA. Kelompok IV yaitu kelompok kontrol pelarut yaitu kelompok tikus yang diberikan pelarut

Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008

Diah Ayu Putri K, Perdana Adhi Nugroho, Andita Pra Darma, Muthi Ikawati, Sugeng Riyanto dan Edy Meiyanto

ekstrak berupa CMC-Na 0,5%. Kelompok V adalah kelompok perlakuan ekstrak (1500 mg/kgBB). Kelompok V tidak diberi DMBA dan diberi perlakuan ekstrak dengan cara dan frekuensi yang sama dengan kelompok DMBA+dosis. Setelah didiamkan selama 5 minggu dari masa perlakuan DMBA, hewan uji dinekropsi dan dilakukan pemeriksaan makroskopis dengan melihat adanya nodul tumor pada organ hepar. Preparasi organ dilakukan dengan memfiksasi organ hepar dengan buffer formalin 4%. Selanjutnya dibuat preparat organ dalam slide kaca untuk diamati secara mikroskopis kajian histopatologisnya menggunakan metode pengecatan Hematoxylin Eosin (HE) dan imunohistokimia (IHC) untuk mengamati ekspresi c-Myc pada sel hepar tikus. Pemeriksaan ini dibawah mikroskop binokuler di Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran UGM.
Uji in silico

perlakuan DMBA+ekstrak dengan dosis 750 mg/kgBB dan 1500 mg/kgBB yang diberikan setiap hari selama 10 hari, juga tidak ditemukan adanya perubahan makroskopis, hasil yang demikian juga terjadi pada kelompok kontrol ekstrak. Dari hasil tersebut dapat diartikan bahwa tidak terjadi perubahan makroskopis struktural pada semua kelompok hewan uji.

Senyawa uji dibuat struktur 3 dimensi (3D) menggunakan software Molecular Operating Environment. Struktur dengan nilai Hf dan energi terendah digunakan untuk didockingkan pada proten-protein target yang diperoleh dari database PDB di download dari situs http/www/pdbbeta.rscb.org/pdb. Senyawa uji di-docking-kan pada ligan binding site dengan menggunakan program MOE. Scoring function yang digunakan adalah Score.
Analisa Data

Gambar 1. Gambaran makroskopis hepar hewan uji. Hepar hewan uji (tikus) kelompok perlakuan DMBA (a), perlakuan DMBA + dosis I (750 mg/ kgBB) (b) perlakuan DMBA+dosis II (1500 mg/kg BB) (c) perlakuan pelarut CMC-Na (d) kontrol ekstrak (e). Tidak tampak adanya nodul pada hepar semua kelompok hewan uji. Untuk menegaskan diagnosis bahwa memang tidak terbentuk tumor pada hepar hewan uji, perlu dilakukan pemeriksaan secara mikroskopis. Menurut King (2000) diagnosis tumor tidak hanya berdasarkan penampakan dari sel, tetapi juga berdasarkan architecture jaringan yang akan menggambarkan hubungan antara sel neoplasma dengan matriks ekstraseluler dan sel yang lain. Analisis mikroskopis dilakukan dengan pengamatan hasil pengecatan HE pada organ hepar hewan uji (Gambar 2).

Evaluasi hasil uji meliputi pengamatan keadaan histologi organ hepar dari hasil pengecatan HE ekspresi protein c-Myc dari hasil pengecatan IHC dan score hasil docking. Hasil dan Pembahasan Perubahan makroskopis yang mengarah pada pembentukan nodul tidak ditemukan pada tikus kelompok perlakuan ekstrak apabila dibandingkan dengan kelompok perlakuan pelarut (Gambar 1). Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanolik jeruk keprok tidak besifat karsinogen terhadap hewan uji. Pada kelompok
Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008

Potensi Kemopreventif Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Keprok

terlokalisasi pada daerah tersebut sedangkan sel yang normal (tidak mengekspresian N-Ras dan c-Myc) akan berwarna biru pada membran disekitar inti selnya (Gambar 3). Tingkat ekspresi c-Myc dinyatakan dengan jumlah sel yang mengekspresikan c-Myc.

Gambar 2. Gambaran histologi kelompok perlakuan. Hepar hewan uji (tikus) kelompok perlakuan DMBA, terjadi perubahan susunan hepatosit yang tidak lagi teratur yang menunjukan hiperproliferasi (a); perlakuan DMBA + dosis I (750 mg/ kgBB) (b) dan perlakuan DMBA+dosis II (1500 mg/kg BB) (c), tidak tampak adanya infiltrasi sel radang maupun kongesti; perlakuan pelarut CMC-Na (d) dan kontrol ekstrak (e), terlihat susunan hepatosit yang masih teratur, inti sel-sel hepar tampak normokromatis tercat ungu, bentuk sel tampak sama (isositosis) dan tidak terdapat kelainan pada sitoplasma. Walaupun tidak tampak adanya perubahan signifikan (hanya berupa hiperproliferasi) secara mikroskopis pada sel hepar pada kelompok hewan uji terinduksi DMBA yang mengarah pada pembentukan tumor, tidak dapat dipastikan tidak terjadi perubahan pada ekspresi gen-gen regulator pertumbuhan yang bertanggung jawab terhadap pembentukan tumor. Pengecatan dengan HE tidak mampu memberikan informasi perubahan ekspresi protein N-ras dan c-Myc secara eksplisit, sehingga diperlukan suatu metode imunohistokimia yang dapat memberikan informasi ekspresi protein c-Myc secara spesifik berdasarkan reaksi antigen-antibodi. Hasil reaksi antigenantibodi ini akan divisualisasi dengan kromogen DAB (3,3-Diaminobenzidin) yang akan berwarna coklat dibawah mikroskop. Sel yang mengekspresikan c-Myc akan tampak paling coklat pada daerah membran sel di dekat inti karena N-ras yang aktif

Gambar 3. Gambaran hasil pengecatan imunohistokimia sel hepar tikus Pengecatan dilakukan dengan antibodi primer N-ras (IgG1) yang menunjukkan sel yang mengekspresikan protein N-ras. Banyaknya sel yang mengekspresikan protein N-ras ditunjukkan dengan jumlah sel yang berwarna coklat gelap pada membran di sekitar inti selnya (tanda panah). DMBA+ekstrak dosis 750 (a), DMBA+ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (b), kontrol pelarut CMC-Na 0,5% (c), DMBA dosis 20 mg/kgBB (d), kontrol ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (e). Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Pengamatan preparat imunohistokimia pada kelompok perlakuan DMBA menunjukkan jumlah sel hepar yang mengekspresikan c-Myc lebih banyak dibandingkan kelompok lainnya. Secara deskriptif terlihat bahwa perlakuan ekstrak memiliki gambaran yang mirip dengan kelompok perlakuan pelarut sedangkan kelompok perlakuan DMBA-ekstrak dosis 1500 mg/kg BB menunjukkan kecenderungan lebih menurunkan jumlah sel hepar yang mengekspresikan c-Myc

Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008

Diah Ayu Putri K, Perdana Adhi Nugroho, Andita Pra Darma, Muthi Ikawati, Sugeng Riyanto dan Edy Meiyanto

dibandingkan perlakuan DMBA-ekstrak dosis 750 mg/kgBB (Gambar 3). Dari data diatas dapat dipastikan bahwa pemaparan DMBA mampu menyebabkan perubahan yang nyata pada ekspresi c-Myc sel hepar tikus. Berdasarkan data diatas pula, dapat diketahui dosis ekstrak yang mampu menurunkan ekspresi c-Myc pada hewan uji tercapai pada dosis 1500 mg/kgBB. Dosis ekstrak tersebut dapat menekan jumlah sel hepar yang mengekspresikan c-Myc sehingga dapat menghambat inisiasi karsinogenesis pada hepar. Walaupun demikian dosis tersebut belum merupakan dosis efektif ekstrak yang dapat menurunkan ekspresi c-Myc, sebab penurunan yang terjadi belum mencapai level yang mendekati level ekspresi normal sepert level ekspresi c-Myc pada perlakuan pelarut. Oleh karena itu pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan optimalisasi dosis efektif ekstrak dengan cara peningkatan dan penyempitan kisaran dosis yang dapat berefek optimal terhadap penurunan ekspresi c-Myc. Interaksi antara tangeretin dengan cSrc yaitu ikatan hidrogen antara atom O dari gugus metoksi O-CH3 dari tangeretin pada posisi 8 dan 4 dengan residu Gln 253 dan Lys 401 yang kontak dengan solven (Gambar 4). Gugus ini berikatan pula dengan solven yang ada di sekitar pocket protein target c-Src. Ikatan pada tangeretin ini jauh lebih banyak dibandingkan dengan nobiletin yang hanya membentuk ikatan hidrogen dengan solven di sekeliling pocket reseptor dan tidak berikatan secara langsung dengan residu asam amino pada pocket reseptor c-Src. Pada nobiletin interaksi yang terjadi hanyalah berupa ikatan hidrogen dari solven dengan seluruh substituen gugus metoksi dari kerangka flavonoid Nobiletin. Ikatan ini bersifat lemah karena senyawa uji tidak berinteraksi langsung dengan residu asam amino dari pocket reseptor. Akibatnya skor yang didapatkan lebih besar dibandingkan Tangeretin karena Interaksi yang terjadi ini adalah lemah dan lebih sedikit dibandingkan interaksi antara tangeretin dan c-Src. Oleh karenanya dimungkinkan aktivitas

penghambatan c-Src oleh tangeretin lebih besar daripada nobiletin.

Gambar 4. Pemodelan tiga dimensi hasil docking pada pocket protein target c-Src dengan nobiletin (a), Tangeretin (b), ligan endogen ATP (c) dan ligan pembanding Imatinib (d). Imatinib dengan konformasi 3 dimensi yang meruah memanjang dan khas memberikan surface area yang memanjang dan memberikan kemungkinan lebih besar dalam berinteraksi dengan pocket protein target c-Src Hasil docking antara c-Src dengan tangeretin menghasilkan score -11,6616 yang nilainya lebih besar daripada imatinib-c-Src 16,6733 (Tabel 1). Begitu pula score docking nobiletin dengan c-Src yaitu -10,4267 lebih besar daripada imatinib-c-Src (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa ikatan antara imatinib dengan c-Src lebih stabil sehingga menyebabkan aktivitas inhibitor terhadap cSrc lebih tinggi. Skor yang diperoleh antara ATP-c-Src didapat nilai yang lebih rendah dibandingkan dengan tangeretin dan nobiletin yaitu 15,3059 kkal/mol. Ini berarti bahwa ikatan antara ATP dan c-Src lebih stabil dibandingkan dengan ikatan c-Src tangeretin ataupun c-Src Nobiletin. Afinitas ATP terhadap c-Src lebih besar ikatan hal ini dikarenakan karena ATP merupakan senyawa endogen yang memang mempunyai binding site dengan protein kinase Senyawa di dalam ekstrak etanolik kulit jeruk C. reticulata yang diduga mempunyai efek penurunan insidensi kanker adalah senyawa golongan flavonoid terutama golongan polimetoksiflavon. Target aksi yang 5

Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008

Potensi Kemopreventif Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Keprok

efektif pada penghambatan tersebut adalah protein kinase yang berperan penting dalam signal transduksi sel seperti c-Src yang berfungsi dalam aktivasi expresi c-Myc. Hal ini dapat dibuktikan melalui docking yang membuktikan bahwa tangeretin dan nobiletin mampu berikatan dengan c-Src meskipun dengan energi yang lebih tinggi dari ligan

pembanding imatinib. Oleh karena itu senyawaan polimetoksiflavon dalam ekstrak kulit jeruk keprok melalui penelitian ini dapat mengurangi insidensi kanker pada sel hepar melalui mekanisme penghambatan protein kinase c-Src.

Tabel 1. Score hasil docking ligan uji, ligan pembanding, dan ligan endogen dengan c-Src Ligan Ligan Ligan uji Score Score Score pembanding endogen Tengeretin -11,6616 Imatinib -16,6733 ATP -15,3059 Nobiletin -10,4276 Kesimpulan Pemodelan kanker dengan pemberian perlakuan ekstrak etanolik kulit jeruk keprok post-inisiasi secara empiris mampu menggambarkan efektifitas pemberian ekstrak etanolik Citrus reticulata dalam menurunkan insidensi kanker pada tikus galur Sprague Dawley terinduksi DMBA. Secara in-silico, mekanisme penghambatan ekspresi onkogen c-Myc ini adalah melalui inhibisi c-Src yang dibuktikan Daftar Pustaka Brack, M.E., Boterberg, T., Depypere H.T., Stove, C., Leclercq, G. and Mareel M.M., 2002, The citrus methoxyflavone tangeretin affects human cell-cell interactions, Adv Exp Med Biol.,505:135-9. Fong, Tse-Ling, 2002. Hepatocellular Carcinoma (Liver Cancer), www.medicinet.com, diakses September 2007. King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd Ed., Pearson Eduation Limited, London. Mitchell, W. 1998. Plant Medicine. Private publication, Seattle Pan, M.H., Chen, W.J., Lin-Shiau, S., Ho, C.H. and Lin, J.K., 2002, Tangeretin Induces Cell-Cycle Through Inhibiting Cyclin-Dependent Kinase 2 & 4 Activities As Well As Elevating Cdk Inhibitor p21 in Human Colorectal Carcinoma Cells, Carcin., 23: 1677-1684. Thuluvath, P.J., Choti, M., Geschwind J.F., Norwitz L. and Kalloo A.N., 2006, Liver Cancer, http://gastro.nts.jhu.edu, diakses September 2006. Walle, U.K. and Walle, T., 2007, Bioavailable flavonoids: cytochrome P450-mediated metabolism of methoxyflavones, Drug Metabolism and Disposition, 35(11):1985-1989. Zhai, S., Dai, R.., Friedman, F.K. and Vestal, R.E., 1998, Comparative inhibition of human Cytochromes P4501A1 and 1A2 by flavonoids, The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 26(10): 989-992. Zhang, F.L., Kirschmeier P., Carr, D., James, L., Bond, R.W., Wang, L., Patton, R., Windsor, William T. And Bishop, W.R., 1997, Characterization of Ha-Ras, N-Ras, Ki-Ras4A, and KiRas4B as in Vitro Substrate for Farnesyl Protein Transferase and Geranylgeranyl Transferase Type I, J. Biol. Chem., 272(15):10232-10239. dengan afinitas dan kekuatan ikatan yang cukup stabil pada Tangeretin terhadap residu asam amino pada protein target c-Src. Ucapan Terima Kasih Terimakasih kepada DP2M DIKTI yang telah membantu mendanai penelitian ini melalui PKM tahun 2008.

Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008