MOLEKLER B YOLOJ TEKN KLER II UYGULAMA K TABI MBG603

MOLEKLER B YOLOJ VE GENET K BLM

Dr. Neslihan Ergen

GENEL KULLANIM N HAZIRLANMASI GEREKEN STOK SOLSYONLAR RNase-free steril distile su (DEPC-treated water) : 2 litre Her 100 ml su iin 0.1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) eklenir ve eker ocak altnda gece boyu kartrlarak tamamen znmesi salanr. Daha sonra otoklavlanarak DEPCnin deaktive edilmesi gerekmektedir. % 70 EtOH (v/v) : 100 ml 70 ml absulut etanole 30 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazrlanr. % 75 EtOH (v/v) : 100 ml 75 ml absulut etanole 25 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazrlanr. % 10 SDS (w/v) : 100 ml 10 gr SDS 80 ml distile su ierisinde gece boyu kartrarak zlr. Hacim yine distile su kullanlarak 100 mlye tamamlanr. Oda scaklnda saklanmaldr. 0.5 M Tris (pH 6.8) : 100 ml 6 gr Tris baz 60 ml distile su ierisinde zndkten sonra 6 N HCl kullanlarak pHs 6.8e ayarlanr. Hacim distile su ile 100 mlye tamamlandktan sonra otoklav ile steril edilerek saklanr. 0.5 M Tris (pH 7.5) : 100 ml 6 gr Tris baz 60 ml distile su ierisinde zndkten sonra 6 N HCl kullanlarak pHs 7.5e ayarlanr. Hacim distile su ile 100 mlye tamamlandktan sonra otoklav ile steril edilerek saklanr. 1.5 M Tris (pH 8.8) : 100 ml 27.23 gr Tris baz 80 ml distile su ierisinde zndkten sonra 6 N HCl kullanlarak pHs 8.8e ayarlanr. Hacim distile su ile 150 mlye tamamlandktan sonra otoklav ile steril edilerek saklanr.

% 0.5 (w/v) Bromofenol mavisi : 10 ml 0.05 gr bromofenol mavisi 10 ml su ierisinde zdrlr. znmeyen paracklarn kalmas durumunda filtreden geirilerek oda scaklnda saklanr. 20X MOPS tamponu : 100 ml 0.4 M MOPS (8.73 gr) 0.1 M NaAc (1.36 gr) 20 mM EDTA (0.74 gr) Yukarda verilen gramajlar 80 ml distile su ierisinde zldkten sonra 5 M NaOH kullanlarak pH 7.0a ayarlanr. pH ayarlamasndan sonra hacim 100 mlye tamamlanr. Otoklav ile steril edildikten sonra k almayacak ekilde karanlk bir ortamda saklanr. RNA MOPS jel ykleme tamponu : 1 ml % 50 gliserol 1X MOPS tamponu (20X MOPS tamponundan seyreltilerek) % 1 bromofenol mavisi (bromophenol blue) Hcre lizis tamponu : 10 ml 150 mM NaCl %1 NP-40 50 mM Tris-HCl Yukarda verilen kompozisyon distile su ierisinde zndkten sonra pH 8.0a ayarlanr. Lizis tamponu -20Cde saklanr ve kullanmadan nce ierisine 1 mM PMSF (phenylmethanesulphonylfluoride) ve proteaz inhibitr kokteyli eklenir. 1 mM PMSF metanol ierisinde zerek taze olarak hazrlanr ve kullanlr. Proteaz inhibitr kokteylinin hazrlanmas iin her bir tablet 1 ml steril PBS veya distile su ierisinde zndkten sonra -20Cde saklanr. Kullanlacak olan her 1 ml lizis tamponu iin 50l kokteyl eklenmesi gerekmektedir.

Toplam protein izolasyon tamponu : 10 ml 56 mM Na2CO3 56 mM DDT % 2 SDS % 12 Sucrose 2 mM EDTA Yukarda verilen kompozisyon 6 ml distile su ierisinde zndkten sonra SDS eklenmesi yaplr ve znmesi salanr. Hacim distile su kullanlarak 10 mlye tamamlanr ve k almayacak ekilde saklanr. SDS protein indirgeme tamponu : 10 ml 3.55 ml distile su 1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 2.5 ml gliserol 2 ml % 10 (w/v) SDS 0.2 ml % 0.5 (w/v) bromofenol mavisi Kartrldktan sonra oda scaklnda saklanr. Kullanlmadan nce 950 l indirgeme tamponuna 50 l -mercaptoethanol eklenmesi gerekmektedir. 10X SDS-PAGE yrtme tamponu : 500 ml 15.2 gr Tris baz 72 gr glisin 5 gr SDS Yukarda verilen gramajlar 300 ml distile su ierisinde zndkten sonra hacim 500 mlye tamamlanr. Hazrlanan tamponun 4Cde saklanmas gerekmektedir. Bu srada bir kme olursa kullanmadan nce oda scaklna stlmas gerekmektedir. % 10 (w/v) APS (ammonium persulfate) : 10 ml 1 gr APS 10 ml distile su ierisinde zdrlerek hazrlanr. APSnn taze kullanlmas gerektii iin -20Cde saklanmas ve kullanlmadan nce zdrlmesi gerekmektedir.

Coomassie boyama solsyonu : 500 ml % 0.2 (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 % 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik asit ierisinde zdrlr. znmeyen paracklarn kalmas durumunda filtreden geirilerek oda scaklnda saklanr. 10X TBST (Tris buffered saline with Tween 20) : 500 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl % 0.05 (v/v) Tween-20 Western blotlama transfer tamponu : 100 ml 48 mM Tris baz 39 mM glisin % 20 metanol % 0.0375 (w/v) SDS Western blotlama membrana aktarm sonras boyama solsyonu : 100 ml % 0.1 Ponceau red Steril distile su ierisinde hazrlanarak, ktan korunacak ekilde saklanr.

PROTOKOL: Bitkilerden Trizol Kullanlarak RNA zolasyonu Materyal Bitki yapraklar zelti ve Tamponlar a. Trizol Reagent (Invitrogen) b. Kloroform c. % 75 EtOH (v/v) d. zopropanol e. Distile su (RNase-free) Ara ve Gereler Sv azot Havan 2.0 ml steril mikrofj tpleri 1.5 ml steril mikrofj tpleri Soutmal santrifj Pipet ve steril pipet ular Tp kartrc (vorteks) Su banyosu (55C) Uygulama 1. 0.3 gram bitki dokusu sv azot yardmyla toz haline getirilir ve 1.7 ml Trizol Reagent eklenerek homojenize edilir. 2. 1 ml homojenize edilmi rnek 2 ml mikrofj tpne aktarlr. Bu aamada kesik u kullanlmas gerekebilir. Tm rnekler hazrlanana kadar mikrofj tpne aktarlm olan rnekler buzda tutulmaldr. 3. rnee 400 l kloroform eklenir ve elde sallanarak kartrlr. 4. Oda scaklnda 7 dakika bekletilen rnekler daha sonra maksimum hzda 4Cde 15 dakika santrifj edilirler. 5. 1.5 ml eppendorf tpe aktarlan st faza 500 l izopropanol eklenir ve oda scaklnda 10 dakika bekletilir. 6. Maksimum hzda 4Cde 10 dakika santrifj edilen rneklerdeki st faz RNA peletini oynatmadan dikkatlice dklr. 6

7. rneklere 1 ml % 75lik EtOH eklenir ve 9,000 rpmde 4Cde 5 dakika sre ile santrifj edilir. 8. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dklr. Bu aamada kalan etanolun ortamdan uzaklatrlmas iin mikropipet kullanlabilir. 9. Pelet oda scaklnda 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur. Ar kurutmak RNA peletinin znmesini engelleyeceinden kurutma sresine dikkat edilmesi gereklidir. 10. Oluan pelete 30-50 l RNase-free distile su eklendikten sonra znmesini salamak iin 55Cde 1 saat bekletilir. 11. zole edilen RNA rnekleri uzun sreli saklamalarda -80Cde muhafaza edilmelidirler. Ancak ksa sreli saklamak amal -20C de tutulabilir.

PROTOKOL: Memelilerden TriPure Kullanlarak RNA zolasyonu Materyal Hcre kltrnden elde edilen tek tabakal memeli hcreleri (Bir grup hcreye ila uygulamas yaplmken, dier bir grup normal koullarda bytlmtr.) Hcrelere ila uygulanmas: la stok konsantrasyonu: 10 mM Uygulama iin gereken konsantrasyona indirgenen ila, bytme ortam ile seyreltilerek hazrlanr. Kuyularda bytlen memeli hcrelerinden bytme ortam ekilip atlr. Daha sonra ilal bytme ortam ekili hcrelerin zerine eklenerek, ila uygulama sresi kadar (24 saat) bytmeye devam edilir. zelti ve Tamponlar a. TriPure Isolation Reagent (Roche Applied Sciences) b. Kloroform c. % 70 EtOH (v/v) d. Etanol e. Distile su (RNase-free) f. 1X PBS Ara ve Gereler 1.5 ml steril mikrofj tpleri Soutmal santrifj Pipet ve steril pipet ular Tp kartrc (vorteks) Su banyosu (55C) Uygulama 1. 6 kuyulu petrilere ekilmi ve % 90dan fazla yaygnla ulat mikroskop ile saptanm olan memeli hcreleri 2 kez souk 1 ml 1X PBS tamponu ile ykanr. Hcrelerin ykanmas besiyeri ieriinin tamamen uzaklatrlmas asndan nemlidir. Ancak yzeye yapan hcrelerin ykama esnasndan kaldrlmamas iin uygulama zenli bir ekilde yaplmaldr. 2. Hcrelere 1 ml souk 1X PBS eklenmesinin ardndan kazyc yardm ile tm hcre materyali kaldrlr ve 1.5 ml steril mikrofj tpne aktarlr. En son kalan hcre topluluunu aktarmak iin 0.5 ml souk 1X PBS 6 kuyucuklu hcre petrisine konur ve kazyc yardmyla son hcreler de alnarak ayn 1.5 ml mikrofj tpnde tm materyal toplanr. 8

3. Hcreler maksimum hzda daha nce soutulmu santrifjde 4Cde 30 saniye sre ile kertilir. st sv dikkatli bir ekilde yeni bir steril mikrofj tpne aktarlr. 4. rneklere 250 l TriPure Reagent eklenir ve oda scaklnda 5 dakika bekletilir. 5. rneklere 50 l kloroform eklenir ve 15 saniye sre ile kartrlr. 6. Oda scaklnda 15 dakika bekletilen rnekler daha sonra maksimum hzda 4Cde 15 dakika santrifj edilirler. 7. st faz yeni bir mikrofj tpne aktarlr ve zerine 125 l etanol eklenir. Mikrofj tp alt st edilerek kartrlr ve oda scaklnda 5 dakika bekletilir. 8. Maksimum hzda 4Cde 10 dakika santrifj edilen rneklerdeki st faz RNA peletini oynatmadan dikkatlice dklr. 9. rneklere 250 l % 70lik EtOH eklenir ve 8,000 rpmde 4Cde 5 dakika sre ile santrifj edilir. 10. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dklr. Bu aamada kalan etanolun ortamdan uzaklatrlmas iin mikropipet kullanlabilir. 11. Pelet oda scaklnda 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur. Ar kurutmak RNA peletinin znmesini engelleyeceinden kurutma sresine dikkat edilmesi gereklidir. 12. Oluan pelete 30-50 l RNase-free distile su eklendikten sonra znmesini salamak iin 55Cde 1 saat bekletilir. 13. zole edilen RNA rnekleri uzun sreli saklamalarda -80Cde muhafaza edilmelidirler. Ancak ksa sreli saklamak amal -20C de tutulabilir.

PROTOKOL: Spektrofotometre ile RNA Miktarnn Hesaplanmas Materyal zolasyonu gerekletirilen bitki ve memeli RNA rnekleri Ara ve Gereler Kuartz spektrofotometri kvetleri Spektrofotometre Pipet ve steril pipet ular 1.5 ml mikrofj tpleri Uygulama 1. 1.5 mllik iki mikrofj tp K (Kr, Blank) ve (rnek) eklinde iaretlenir. 2. rnei ieren tpn ierisine ncelikle 98 l distile su, daha sonra da 2 l RNA izolat konularak pipet yardmyla kartrlr. Bu aamada 1:50 seyreltme yaplm olur. 3. Kr tp sadece 100 l distile su iermektedir. 4. Spektrofotometrede nkleik asitler iin lm yaplan 3 numaral dosya alr ve yaplan seyreltme ve dorulama faktrleri gibi ayarlamalar yaplr. Kullanlan spektrofotometreye gre bu aamann deiecei unutulmamaldr. 5. Referans deerler K kodlu tpten elde edilen lm ile sfrlanr. Bu aamada gerekletirilen solsyondan ileri gelecek olan spektrofotometrik alglamalarn sfrlanmasdr. Bu ekilde rnekten yaplacak lmlerin sadece rnek ierisinde zlm moleklleri tespit etmesi salanr. 6. kodlu tpn lm deerleri (260 nm, 280 nm ve saflk deerleri) laboratuar defterine aktarlr. Alet tarafndan llen RNA miktar ng/l olarak deftere alnr. Proteinler 280 nmde absorbsiyon gsterdikleri iin OD 260/OD 280 deeri hesaplanr. Eer bu deer 1.8-2.0 arasnda ise elde edilen nkleik asitlerin temiz olduu varsaylr. RNA konsantrasyonu (g/ml) = (OD260 x Seyreltme katsays x 40 g/ml) / 1000 Not: Absorbansn 1 deeri 1 cm3lk kvette 50 g/ml miktarnda ift zincirli DNAy, 33 g/ml tek zincirli oligonkleotidleri ve 40 g/ml ise tek zincirli RNAy temsil etmektedir.

10

Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlanmas Spektrofotometri ile llen 260 nm ve 280 nm deerleri kullanlarak izole edilen RNA rneklerinin konsantrasyonlarnn ve saflk derecelerinin hesaplanmas, karlatrlmas ve sonularn deneysel uygulama aamalar asndan deerlendirilmesi.

11

PROTOKOL: RNAdan iScript cDNA Synthesis Kiti (Bio-Rad) ile cDNA Sentezi ve Spektrofotometre ile cDNA Miktarnn Hesaplanmas Materyal la uygulanm ve kontrol memeli hcrelerinden izole edilen RNA rnekleri zelti ve Tamponlar iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad) Ara ve Gereler 0.5 ml steril mikrofj tpleri 1.5 ml steril mikrofj tpleri Su banyosu (45C, 42C, 85C) Soutmal santrifj Tp kartrc (Vorteks) Kuartz spektrofotometri kvetleri Spektrofotometre Pipet ve steril pipet ular Uygulama 1. RT reaksiyon karm aadaki ierie gre toplamda 20 l olacak ekilde hazrlanr; 4 l 5X iScript Reaction Mix 1 l iScript Reverse Transcriptase 1 l RNA rnei 14 l Nuclease-free su 2. Hazrlanan karm voktekslenir ve hacmin tpn dibinde birikmesini salamak amacyla ksa sre santrifj edilir. 3. Hazrlanan RT reaksiyon karm aadaki scaklk ve srelerde bekletilerek cDNA sentezi gerekletirilir. 25C 5 dakika 42C 30 dakika 85C 5 dakika 4. Spektrofotometre ile sentezlenen tek zincirli cDNAnn kantifikasyonu yaplr. cDNAya evrilen RNA rneklerinin -20Cde saklanmas gerekmektedir. cDNA konsantrasyonu (g/ml) = (OD260 x Seyreltme katsays x 33 g/ml) / 1000 12

Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlama cDNA konsantrasyonlarnn hesaplanmas. Reaksiyona konulan RNA miktarna gre cDNA amplifikasyon miktarnn deerlendirilmesi. Sentezlenen cDNAnn neden spektrofotometre ile hesaplandnn ve bir jel elektroforez yntemi ile deerlendirilmediinin yorumlanmas.

13

PROTOKOL: zole Edilen RNAlarn MOPS Jel Elektroforez Yntemi ile Gsterimi Materyal zolasyonu gerekletirilen bitki ve memeli RNA rnekleri zelti ve Tamponlar a. 20X MOPS tamponu b. RNA MOPS jel ykleme tamponu c. MOPS jel yrtme tamponu 25 ml 20X MOPS ve 13.5 ml formaldehit 400 ml steril distile suya eklenir ve hacim 500 mlye tamamlanr. d. Formaldehit e. Agaroz f. Distile su (RNase-free) g. Etidyum bromr Ara ve Gereler 1.5 ml steril mikrofj tpleri Jel elektroforez sistemi G kayna UV-translminatr Pipet ve steril pipet ular Mikrodalga frn Su banyosu (65C) Uygulama 1. 50 ml MOPS agaroz jeli hazrlamak iin 0.7 gram agaroz 39 ml RNase-free distile su ierisine konulur. Mikrodalga frnda tamamasna zen gsterilerek agaroz tamamen eriyene kadar kaynatlr. Daha sonra oda ssnda veya musluk altnda elle dokunulabilir scakla eriene kadar soutulur ve ierisine 2.5 ml 20X MOPS ve 8.5 ml formaldehit eklenir. Kabarcklarn olumamasna dikkat ederek kartrlr. MOPS ve formaldehit eklenmesi zaten soutulmu olan agaroz jel zeltisinin daha fazla soumasna neden olaca iin, dkme ileminin agaroz tamamen jel haline dnmeden hzl bir ekilde gerekletirilmesi gerekmektedir.

14

2. Jel taraklar elektroforez tanknda uygun yerlere yerletirilir ve 3-5 mm kalnlnda bir jel dklr. Eer hava kabarc olumu ise pipet ucu veya kat peete yardmyla ortamdan uzaklatrlmaldr. 3. Tamamen donduktan sonra taraklar kuyucuklarn bozulmamasna zen gsterilerek kartlr ve jel, ierisinde MOPS jel yrtme tamponu bulunan tanka aktarlr. Tampon zeltisinin hazrlanan jelden 1 mm daha yksek olmas yeterlidir. 4. zole edilen RNA rneklerinin yklenmesi iin aadaki ekilde hazrlanmas

gerekmektedir; 3.3 l formaldehit 1 l 20X MOPS tamponu 2 l RNA MOPS jel ykleme tamponu 1l EtBr X l RNA rnei (2 g olacak hacme gre hesaplanr) Y l RNase-free distile su (20 lye tamamlanacak ekilde hesaplanr) 1.5 ml mikrofj tp ierisinde hazrlanan rnekler 65Cde 10 dakika tutulduktan sonra hzla buza aktarlrlar. rnekler tamamen souduktan sonra jel zerindeki kuyucuklara dikkatlice yklenir. lk kuyuya RNA standart (RiboRuler RNA Ladder High Range, Fermentas) yklenir. 5. Elektrotlarn doru olarak yerletirildiinden emin olduktan sonra voltaj 1-5 V/cm olacak ekilde hesaplanr (cm pozitif ve negatif elektrot arasndaki uzaklktr). Mini jellerde ise 10100 ng DNA 30-60 dakika ierisinde 5-20 V/cm olacak ekilde yrtlebilmektedir. 6. Ykleme tamponunun grlebilir boyalar jelin 2/3ne ulatnda yrtme durdurulur. 7. Jel transiluminatrde UV altnda gzlemlenir. Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlanmas zole edilen toplam RNA rneklerinin jel grntleri ile spektrofotometrik analiz sonucu hesaplanan konsantrasyonlarnn karlatrlarak yorumlanmas. Memeli ve bitkiden izole edilen RNA rneklerinin konsantrasyon farklarnn ve grntlenen bantlarn yorumlanmas. Sonularn deneysel uygulama aamalar asndan deerlendirilmesi.

15

PROTOKOL: qRT-PCR ile PUMA Geninin Anlatmnn Kantifikasyonu Materyal la uygulanm ve uygulanmam (kontrol) memeli hcrelerinden elde edilen cDNA rnekleri zelti ve Tamponlar a. SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) b. PUMA primerleri (Hedef gen) c. GADPH primerleri (Referans, kontrol gen) Ara ve Gereler 0.2 ml steril mikrofj tpleri Pipet ve steril pipet ular Mini Opticon Thermal Cycler (Bio-Rad) Uygulama 1. Kantifikasyonun yaplabilmesi iin kullanlacak olan Pfaffl metodu iin gereken deerlerin elde edilebilmesi amacyla qRT-PCR reaksiyonlarnn aadaki olaslklar iin hazrlanmas gerekmektedir. Ayn ekilde standart sapmann hesaplanmas amacyla her bir olaslktan iki adet PCR gerekletirilecei iin toplamda 12 reaksiyon hazrlanmas gerekmektedir. 100 ng kontrol cDNA 300 ng kontrol cDNA 500 ng kontrol cDNA 500 ng kontrol cDNA 500 ng ila uygulanm cDNA 500 ng ila uygulanm cDNA GADPH primerleri (Standart) GADPH primerleri (Standart) GADPH primerleri (Standart/Referans) PUMA primerleri (Hedef) GADPH primerleri (Referans) PUMA primerleri (Hedef)

2. 0.2 mllik PCR tpleri ierisinde 25 l PCR karm hazrlanr. X l steril distile su (25 lye tamamlayacak hacimde) 12,5 l 5X SYBR Green PCR Master Mix 0.25 M Primerler Y l cDNA (Gerekli olan ng ayarlayacak hacimde)

16

3. rnekler polimeraz zincir reaksiyonu ile Mini Opticon Thermal Cyclerda oaltlr. Amplifikasyon dngs; Balang denatrasyon 40 siklus Denatrasyon Balanma Uzama 94C 54C 72C 1 dakika 1 dakika 1 dakika 95C 15 dakika

4. Sonular deerlendirilerek, Pfaffl metodu ile kantifikasyon gerekletirilecektir. Bu amala ncelikle aadaki PCR iin elde edilen deerlerden cDNA konsantrasyonuna gre CT deeri grafii izilerek, R2 deeri hesaplanacaktr. Bu aamada standart sapmalarn (SD) deerlendirilmesinin unutulmamas gerekmektedir. Verimli bir amplifikasyon iin R2 deerinin 1e yakn olmas gerekmektedir. 100 ng kontrol cDNA 300 ng kontrol cDNA 500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart) GADPH primerleri (Standart) GADPH primerleri (Standart)

5. Aada verilen PCR rnekleri iin CT denklemlerine gre kontrol grubunda ve ila uygulama sonras PUMA geninin transkript miktar hesaplanacaktr. R = 2-[(CTila uygulanm-CT ila uygulanmam)PUMA (CTila uygulanm-CT ila uygulanmam)GADPH] R = 2-[CThedef gen- CTreferans gen] R = 2-CT

500 ng kontrol cDNA 500 ng ila uygulanm cDNA 500 ng kontrol cDNA 500 ng ila uygulanm cDNA

GADPH primerleri (Referans) GADPH primerleri (Referans) PUMA primerleri (Hedef) PUMA primerleri (Hedef)

17

Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Gerekletirilen PCRn veriminin (yani tekrarlanabilirliinin) yorumlanmas (R2 deeri gz nnde bulundurularak). Kantifikasyon sonularnn hesaplanmas, standart sapmalarn (SD) deerlendirilmesi. la kullanm sonucunda, PUMA geninin transkripsiyonunda gerekleen deiimin yorumlanmas.

Referans makaleler : - Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR, S. Fleige, V. Walf, S. Huch, C. Prgomet, J. Sehm and M. W. Pfaffl , Biotechnology Letters, 2006, 28(19), 1601-1613 - A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, M.W. Pfaffl, Nucleic Acids Research, 2001, 29(9), e45

18

PROTOKOL: Memeli Hcrelerinden Protein zolasyonu Materyal Hcre kltrnden elde edilen tek tabakal memeli hcreleri (Bir grup hcreye ila uygulamas yaplmken, dier bir grup hcre normal koullarda bytlmtr.) Hcrelere ila uygulanmas: la stok konsantrasyonu: 10 mM Uygulama iin gereken konsantrasyona indirgenen ila stou bytme ortam ile seyreltilerek hazrlanr. Kuyularda bytlen memeli hcrelerinden bytme ortam ekilip atlr. Daha sonra ilal bytme ortam ekili hcrelerin zerine eklenerek, ila uygulama sresi kadar (24 saat) bytmeye devam edilir. zelti ve Tamponlar a. Hcre lizis tamponu b. 1X PBS Ara ve Gereler 1.5 ml steril mikrofj tpleri Soutmal santrifj Pipet ve steril pipet ular Uygulama 1. 6 kuyulu petrilere ekilmi ve % 90dan fazla yaygnla ulat mikroskop ile saptanm olan memeli hcreleri 2 kez souk 1 ml 1X PBS tamponu ile ykanr. Hcrelerin ykanmas besiyeri ieriinin tamamen uzaklatrlmas asndan nemlidir. Ancak yzeye yapan hcrelerin ykama esnasndan kaldrlmamas iin uygulama zenli bir ekilde yaplmaldr. 2. Hcrelere 1 ml souk 1X PBS eklenmesinin ardndan kazyc yardm ile tm hcre materyali kaldrlr ve 1.5 ml steril mikrofj tpne aktarlr. En son kalan hcre topluluunu aktarmak iin 0.5 ml souk 1X PBS 6 kuyucuklu hcre petrisine konur ve kazyc yardmyla son hcreler de alnarak ayn 1.5 ml mikrofj tpnde tm materyal toplanr. 3. Hcreler maksimum hzda daha nce soutulmu santrifjde 4Cde 30 saniye sre ile kertilir. st sv hcre peletine zarar vermeyecek ekilde atldktan sonra, pelet zerine 1 ml hcre lizis tamponu konulur ve buzda 40 dakika bekletilir. 4. Maksimum hzda 4Cde 15 dakika santrifj edildikten sonra elde edilen st sv 1.5 mllik steril mikrofj tpne aktarlr ve rnekler -20Cde saklanr.

19

PROTOKOL: Bitkilerden Toplam Protein zolasyonu Materyal Bitki yapraklar zelti ve Tamponlar Toplam protein izolasyon tamponu Ara ve Gereler Sv azot Havan 1.5 ml steril mikrofj tpleri Soutmal santrifj Pipet ve steril pipet ular Su banyosu (70C) Uygulama 1. 0.1 gram bitki dokusu sv azot yardmyla toz haline getirilir ve 500 l toplam protein izolasyon tamponu eklenerek homojenize edilir. 2. Homojenize edilmi rnek 1.5 ml mikrofj tpne aktarlr. Bu aamada kesik u kullanlmas gerekebilir. 3. rnekler 15 dakika 70Cde bekletildikten sonra maksimum hzda 4Cde 10 dakika santrifj edilirler. 4. st sv 1.5 mllik steril bir mikrofj tpne aktarlr ve rnekler -20Cde saklanr.

20

PROTOKOL: zole Edilen Proteinlerin Bradford Yntemi ile Kantifikasyonu Materyal zolasyonu gerekletirilen bitki ve memeli protein rnekleri zelti ve Tamponlar a. Bradford solsyonu (Bio-Rad Protein Assay) b. BSA (10 mg/ml stok) Ara ve Gereler 1.5 ml steril mikrofj tpleri Tp kartrc (vorteks) Spektrofotometri kvetleri Spektrofotometre Pipet ve steril pipet ular Uygulama 1. Bradford solsyonu distile su kullanlarak 1:5 orannda seyreltilir. Bu aamada vorteks yardmyla iyice kartrlmas gerekmektedir. 2. 10 mg/ml BSA stok solsyonu standart eriyi izmeye yetecek miktarda son konsantrasyonu 1 g/l olacak ekilde distile su ile seyreltilir. Hazrlanan BSAnn iyice kartrldndan emin olunmaldr. 3. Standart erinin izilmesi amacyla : a. 800 l Bradford solsyonu spektrofotometri kvetlerine konulur. Bu aamada spektrofotometrinin sfrlanmas amacyla kullanlacak olan Kr (Blank) rnekler de hazrlanr. b. Kvetlere srasyla 2 g, 4 g, 8 g, 12 g ve 18 g olacak hacimde BSA eklenir. Kartrldktan sonra oda scaklnda 5 dakika bekletilir. Standart sapmann (SD) hesaplanmas amacyla her bir g deerinden iki adet bamsz lm yaplmas gerekmektedir. c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda lm yaplr (OD595). 4. rneklerin protein konsantrasyonunu hesaplayabilmek iin: a. 800 l Bradford solsyonu spektrofotometri kvetlerine konulur. Bu aamada spektrofotometrinin sfrlanmas amacyla kullanlacak olan Kr (Blank) rnekler de hazrlanr.

21

b. Kvetlere ncelikle 5l rnek eklenir. Kartrldktan sonra oda scaklnda 5 dakika bekletilir. Standart sapmann (SD) hesaplanmas amacyla her bir l deerinden iki adet bamsz lm yaplmas gerekmektedir. c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda lm yaplr (OD595). lm sonucu elde edilen deer standart erinin izilmesi iin llen deer aralnda ise yeni bir lm yaplmasna gerek yoktur. Ancak BSA lmnde elde edilen araln dnda kadar deerler iin, lm daha az veya daha fazla protein rnek hacmi kullanlarak tekrarlanr. Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlanmas BSA sonular kullanlarak standart erinin izilmesi, R2 deerinin hesaplanmas ve standart sapmalarn yorumlanmas. rneklerden elde edilen protein miktarlarnn standart eri kullanlarak hesaplanmas ve yaplan iki lm arasndaki farkllklara bal olarak standart sapmalarn hesaplanarak yorumlanmas. Farkl hcre trlerinden ve farkl yntemler kullanlarak elde edilen proteinlerin miktar asndan karlatrlarak yorumlanmas. Memeli hcrelerinde ila kullanm sonucunda elde edilen protein miktarnda bir deiiklik gzlenip gzlenmediinin kontrol ve yorumlanmas.

22

PROTOKOL: zole Edilen Proteinlerin SDS-PAGE Jel Elektroforez ile Yrtlmesi ve Coomassie Boyama Materyal zolasyonu gerekletirilen bitki ve memeli protein rnekleri zelti ve Tamponlar a. SDS protein indirgeme tamponu b. % 10 (w/v) SDS c. Akrilamit:Bis-akrilamit zeltisi (37.5:1) d. TEMED e. 10X SDS-PAGE yrtme tamponu f. Coomassie boyama solsyonu g. Coomassie boyama ykama solsyonu % 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik asit steril distile su ile kartrlarak hacmi 500 mlye tamamlanr. h. % 10 (w/v) APS i. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayrma jel tamponu) j. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Ykleme jel tamponu) Ara ve Gereler Poliakrilamit jel elektroforez sistemi G kayna Translminatr Pipet ve steril pipet ular Su banyosu (95C) Uygulama 1. Ayrma jeli iin 50 ml % 12lik akrilamit jel karm hazrlanr. 20 ml Akrilamit:bis-akrilamit zeltisi 12.5 ml Ayrma jel tamponu 0.5 ml % 10 (w/v) SDS 17 ml distile su 2. 500 l % 10 (w/v) APS ve 25 l TEMED eklenir ve yavaa kartrlr. Jel ieriye hava kabarc skmamasna zen gstererek yavaa kasete dklr. zerine ykleme jeli de

23

dklecei iin jel kaseti tamamen doldurulmamal, st ksmnda taraklarn uzunluunun yaklak 1 cm altna denk gelecek ekilde boluk brakarak dklmelidir. 3. st yzeye yaklak 2 mm ykseklie gelecek kadar izopropanol dklr ve jel oda scaklnda donmaya braklr. 4. Ayrma jeli polimerize olduktan sonra kaset eilerek izopropanol dklr. Ayrma jelinin st taraf distile su ile dikkatlice ykanarak alkol kalntlarndan temizlenir ve peete yardmyla dikkatlice kurutulur. 5. Ykleme jeli iin 20 ml % 4lk akrilamit jel karm hazrlanr. 2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit zeltisi 5 ml Ykleme jel tamponu 0.2 ml % 10 (w/v) SDS 12.2 ml distile su 6. 100 l % 10 (w/v) APS ve 20 l TEMED eklenir ve yavaa kartrlr. Jel ieriye hava kabarc skmamasna zen gstererek yavaa kasete dklr ve jel taraklar dikkatlice yerletirilir. 7. Ykleme jeli yarm saat sreyle oda scaklnda dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE yrtme tamponu ile doldurulmu olan tanka yerletirilir. Taraklar dikkatli bir ekilde karlr ve oluan kuyucuklarn ii mikropipet yardmyla ykanr. 8. Protein rnekleri hazrlanrken 30 g protein ierecek hacime 1e 1 orannda SDS protein indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile kartrlr ve 95Cde 5 dakika kaynatldktan sonra buzda souyana kadar bekletilir. 9. lk kuyuya protein standart (Full-range Rainbow, Amersham) yklenir. 10. Hazrlanan protein rnekleri yeterince souduktan sonra jel zerindeki kuyucuklara dikkatlice yklenir. 11. Jel yrtmesi rnekler ykleme jelini geene kadar 100 Vda, getikten sonra ise 200 Vda gerekletirilir. 12. Yrtme tamamlandktan sonra jel kaseti dikkatlice alr ve ayrma jeli, ykleme jelinden ayrlarak Coomassie boyama solsyonuna aktarlr ve gece boyu 3D orbital eviricide bekletilir. 13. Ayrma jeli boyama solsyonundan kartlp, ykama solsyonuna aktarlr ve arka plandaki renk alana ve protein bantlar ayrt edilene kadar ykama solsyonu yenilenerek 3D orbital eviricide ykamaya devam edilir. 14. Jel transiluminatrde beyaz k altnda gzlemlenir.

24

Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlanmas Bitki rneklerinden ve memeli hcrelerinden elde edilen protein izolatlarnn jel grntsnn izolasyon yntemi ve hcre tr asndan karlatrlmas. Bradford sonularna gre gerekletirilen ykleme miktarlar ile jel grntlerinin karlatrlmas ve yorumlanmas.

25

PROTOKOL: Memeli Hcrelerinden zole Edilen Protein rnekleri ile Western Blotlama (PUMA Proteini) Materyal zolasyonu gerekletirilen memeli protein rnekleri zelti ve Tamponlar a. SDS protein indirgeme tamponu b. % 10 (w/v) SDS c. Akrilamit:Bis-akrilamit zeltisi (37.5:1) d. TEMED e. 10X SDS-PAGE yrtme tamponu f. % 10 (w/v) APS g. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayrma jel tamponu) h. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Ykleme jel tamponu) i. 10X TBST j. Western blotlama transfer tamponu k. Western blotlama membrana aktarm sonras boyama solsyonu (Ponceau red) l. Bloklama tamponu 1X TBST ierisinde znm % 5 yasz st tozu m. Birincil antikor solsyonu 1X TBST ierisinde znm % 5 yasz st tozuna 1:2000 orannda PUMA antikoru eklenir. n. kincil antikor solsyonu 1X TBST ierisinde znm % 5 yasz st tozuna 1:10000 orannda antirabbit sekonder antikoru eklenir. Ara ve Gereler Poliakrilamit jel elektroforez sistemi G kayna Pipet ve steril pipet ular Su banyosu (95C)

26

Uygulama 1. Ayrma jeli iin 50 ml % 12lik akrilamit jel karm hazrlanr. 20 ml Akrilamit:bis-akrilamit zeltisi 12.5 ml Ayrma jel tamponu 0.5 ml % 10 (w/v) SDS 17 ml distile su 2. 500 l % 10 (w/v) APS ve 25 l TEMED eklenir ve yavaa kartrlr. Jel ieriye hava kabarc skmamasna zen gstererek yavaa kasete dklr. zerine ykleme jeli de dklecei iin jel kaseti tamamen doldurulmamal, st ksmnda taraklarn uzunluunun yaklak 1 cm altna denk gelecek ekilde boluk brakarak dklmelidir. 3. st yzeye yaklak 2 mm ykseklie gelecek kadar izopropanol dklr ve jel oda scaklnda donmaya braklr. 4. Ayrma jeli polimerize olduktan sonra kaset eilerek izopropanol dklr. Ayrma jelinin st taraf distile su ile dikkatlice ykanarak alkol kalntlarndan temizlenir ve peete yardmyla dikkatlice kurutulur. 5. Ykleme jeli iin 20 ml % 4lk akrilamit jel karm hazrlanr. 2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit zeltisi 5 ml Ykleme jel tamponu 0.2 ml % 10 (w/v) SDS 12.2 ml distile su 6. 100 l % 10 (w/v) APS ve 20 l TEMED eklenir ve yavaa kartrlr. Jel ieriye hava kabarc skmamasna zen gstererek yavaa kasete dklr ve jel taraklar dikkatlice yerletirilir. 7. Ykleme jeli yarm saat sreyle oda scaklnda dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE yrtme tamponu ile doldurulmu olan tanka yerletirilir. Taraklar dikkatli bir ekilde karlr ve oluan kuyucuklarn ii pipet yardmyla ykanr. 8. Protein rnekleri hazrlanrken 30 g protein ierecek hacime 1e 1 orannda SDS protein indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile kartrlr ve 95Cde 5 dakika kaynatldktan sonra buzda souyana kadar bekletilir. 9. lk kuyuya protein standart (Full-range Rainbow, Amersham) yklenir. 10. Hazrlanan protein rnekleri yeterince souduktan sonra jel zerindeki kuyucuklara dikkatlice yklenir. 11. Jel yrtmesi rnekler ykleme jelini geene kadar 100 Vda, getikten sonra ise 200 Vda gerekletirilir. 27

12. Yrtme tamamlandktan sonra jel kaseti dikkatlice alr ve ayrma jeli, ykleme jelinden ayrlr. 13. Western blotlama slak emdirim (wet blotting) metodu ile PVDF membrana aktarlarak gerekletirilecektir. Buna gre aktarm 75 mVda 1 saat 15 dakika sresince veya 25 mVda gece boyu gerekletirilir. Gece boyu aktarm srasnda sistemin soukta tutulmas nemlidir. Blotlama sonras proteinlerin membrana aktarldndan emin olmak amacyla, PVDF membran Western blotlama membrana aktarm sonras boyama solsyonu (Ponceau red) ile yarm saat oda scaklnda 3D orbital eviricide boyanr. Daha sonra su ile ykanarak resmi veya fotokopisi ekilebilir. 14. Blotlama sonras PVDF membran bloklama tamponu ierisinde oda scaklnda 2 saat sreyle 3D orbital eviricide bekletilir. 15. Membrann st tozundan arndrlmas iin 5er dakikalk 3 adet 1X TBST ykama gerekletirilir. 16. Membran daha sonra birincil antikor solsyonuna aktarlr ve 2 saat sreyle oda scaklnda 3D orbital eviricide bekletilir. 17. Membran 5er dakikalk 3 adet 1X TBST ykama sonras ikincil antikor solsyonuna aktarlr ve 2 saat oda scaklnda 3D orbital eviricide bekletilir. 18. Membran 15er dakikalk 2 adet 1X TBST ykama sonras oda scaklna getirilmi kemiluminisans madde ile bir dakika sresince bekletilir. 19. Membran stre filme sarlarak, k geirmez kasetlerde karanlk odaya gtrlr ve zerine film yerletirilir. 20. Belirli srelerde bekletilen filmler gelitirici ve sabitleyici film (Kodak X-OMAT) zeltileri ile istenilen grnt elde edilinceye kadar ykanrlar. Filmler en son souk suda ykanarak kurumaya braklr. Sonularn Deerlendirilmesi ve Rapor Hazrlama Membrana aktarm sonras gerekletirilen Ponceau red boyamas ile elde edilen sonularn deerlendirilmesi ve yorumlanmas. la kullanm sonucunda, PUMA proteininin translasyon ve birikiminde gerekleen deiimin ve elde edilen Western blotlama sonularnn qRTPCRda hesaplanan transkript deiimi sonular ile karlatrlarak yorumlanmas.

28

RAPOR FORMATI 1. Balk sayfas Dersin ad Deneyin ad Tarih Raporu hazrlayan kiinin ad (Tam olarak yazlmal ve okul numaras belirtilmelidir) 2. Ama Deneyin yaplma amacn aka ortaya koymaldr. Bu alma neden yaplmtr? sorusuna cevap verecek nitelikte olmaldr. 3. Materyal ve Metod Deney srasnda kullanlan materyal ve metod mevcut protokollerde kullanlandan farkl olmayacaktr. Bu nedenle bu ksm protokollerden destek alnarak hazrlanabilir. Ancak raporda beklenen detaylar ile verilen protokoln, laboratuarda uygulanan ekilde gncellenerek yazlmas ve zellikle deneyde kullanlan materyallerin, rnein zelti ve tamponlarn, kullanm amalarnn belirtilmesi gerekmektedir. 4. Sonular Bu blmde deney sonular herhangi bir yorum yaplmadan verilmelidir. Sonular tablo, izim, grafik, fotoraf ve bunun gibi ekillerde verilebilir. Btn tablolarn, grafiklerin, izimlerin aklayc isimleri olmal, sembol veya ksaltmalar belirtilmelidir. izimler, tablolar, grafikler ayr ayr numaralandrlmal ve her numara mutlaka rapor iinde belirtilmelidir. 5. Tartma Bu blm sonular yeniden iermemeli, sadece verileri yorumlamaldr. Bu ksm protokollerde mevcut bulunan sonularn deerlendirilmesi bal altnda istenilen kriterlere dayandrlmaldr. Deney teknii ile ilgili sonularnz etkileyen faktrler de bu blmde yer almaldr. Bir nceki blmde verilen sonularn detayl bir tartmasnn yaplmas beklenmektedir. 6. Referanslar

29