SPEKTROSKOPK ANALZ

YNTEMLER
Temel ilkeler
Spektroskopi, bir rnekteki atom, molekl veya
iyonlarn, bir enerji dzeyinden dierine geileri
srasnda absorplanan veya yaylan elektromanyetik
mann llmesi ve yorumlanmasdr.
Elektromanyetik ma, uzayda ok byk hzla hareket
eden bir enerji trdr. Elektromanyetik mann en ok
karlalan trleri, gzle algladmz grnr k ve s
eklinde algladmz infrared nlardr.
Elektromanyetik ma, hem dalga hem tanecik zelliine
sahiptir. nterferans (giriim) ve difraksiyon (krnm)
davranlar dalga zelliiyle aklanr. Bir metal
yzeyinden ma ile elektronlarn koparlmas (fotoelektrik
olay), ma enerjisinin bir madde tarafndan absorpsiyonu
(sourulmas) ve emisyonu (yaylmas) olaylar mann
tanecik zellii (foton) ile aklanr.
Elektromanyetik ma-Madde etkilemeleri:
-Imann krlmas ve yansmas
-Imann salmas
-Imann polarizasyonu
-Imann absorpsiyonu ve emisyonu
Imann krlmas ve yansmas:
Ima bir ortamdan ikinci bir ortama getiinde ksmen
yansr, ksmen de ikinci ortama geer. kinci ortamda
ilerleyen mann frekans deimez, ilerleme yn ve hz
deiir.
Ik demetinin bir ortamdan younluu farkl baka bir
ortama geerken yn deitirmesine krlma (refraksiyon)
ad verilir.
Kritik ann
llmesiyle her
madde iin farkl
krlma indisi
belirlenmitir.
Krlma indisi deerleri, maddelerin belirgin
zelliklerinde biri olarak tanmlanmtr. Krlma
indisinin llmesine dayanan refraktometri
ynteminde, maddelerin krlma indisi deerleri,
maddenin nitel analizinde, saflk derecesinin
belirlenmesinde ve karmlarn nicel analizinde
kullanlmaktadr.
Krlma indisi lm yapan dzenee refraktometre
ad verilir. Refraktometre, idrar dansitesi lmnde
sklkla kullanlr.
Imann salmas:
Fotonun rnekteki paracklara arparak yn
deitirmesine salma ad verilir.
-Grnr blge mas kullanldnda, kolloidal ve
bulank zeltilerde gzlenen salma, Tyndall salmasdr.
-znm molekller veya ok atomlu iyonlardan
salmas Rayleigh salmasdr.
-Paracklarla etkileen dalga boyunun, saan
molekllerin titreim enerji dzeylerine gre deitii
salma tr Raman salmasdr.
Imann polarizasyonu:
Ik dalgas, genellikle her dzlemde ilerleyen dalgalarn
karmdr. Tek bir dzlemde ilerleyen k dalgasna
dzlemsel polarize k denir.
Dzlemsel polarize k ile
asimetrik ve absorplamayan
maddeler etkiletii zaman,
polarize n dzlemi saa (+)
veya sola (-) a deitirir.
Imann absorpsiyonu ve emisyonu:
Kuantum kuramna gre atomlar, ancak elektron
konfigrasyonuna ve d elektronlarnn belirli enerji
dzeyleri arasndaki geilerine bal belirli potansiyel
enerji dzeylerinde bulunabilirler. Elektronlarn bir enerji
dzeyinden dierine geileri ile ilgili atomik
spektrumlar belirlenmitir.
Atomlar, elektromanyetik may absorbe ederek en dk
enerji dzeyinden (temel dzey) uyarlm dzeylere
geerler; bu geilerle ilgili olarak sz konusu atomun
absorpsiyon spektrumlar da belirlenmitir.
hPlank sabiti (6,63x10
-34

vfrekans
Elektromanyetik may absorbe ederek en dk enerji
dzeyinden (temel dzey) uyarlm dzeylere gemi olan
atomlar, temel dzeye dn srasnda ultraviyole veya
grnr blge snrlar iinde ma enerjisi yayarlar
(emisyon). Her atom iin emisyon spektrumu da
belirlenir.
Molekller de atomlarda olduu gibi uygun enerjideki
fotonlarla etkiletiklerinde bu fotonlar absorplayarak
uyarlm hale geerler. Uyarlm molekller, bu kararsz
durumdan fazla enerjilerini yayarak kurtulurlar (molekler
emisyon). Atom spektrumlarndan daha karmak olan
molekler spektrumlar da belirlenir.
Absorplanan fotonlarn says, ortamdaki absorpsiyon
yapan trlerin says ile orantldr. Monokromatik ve I
0

iddetinde ma, ortam daha kk olan I iddetinde terk
eder.
Lambert-Beer kanunu: Bir zeltiden geen k
miktar, n zelti iinde katettii yol ve zelti
konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantl, emilen
k miktar ise doru orantldr.
Transmittans (T)= I/I
0

%Transmittans (%T)=100 T
Absorbans (optik dansite, O.D.)= -log
10
T
Absorbans (A)=c c l
czelti konsantrasyonu (mol/L)
ln zelti iinde kattetii yol (cm)
cmolar absorpsiyon katsays (L/mol/cm)
Bir maddenin rengi, o maddeden gzmze ulaan
grnr blgedeki elektromanyetik nlardr. Bu
nlar, saydam maddeler iin maddenin iinden geip
gelen, saydam olmayanlar iin ise yansyan nlardr.
Madde tarafndan tutulan nlarn
rengi ile maddenin grnr rengini
oluturan nlarn rengi, tamamlayc
renkler olarak adlandrlr:
Sar-Mavi
Krmz-Yeil
Maddelerin rengi, maddelerin tuttuu nn
tamamlaycs olan nn rengidir.
Ik (nm) Absorbe
edilen renk
Grnen
renk
220-380 - -
380-440 Meneke Sar-yeil
440-475 Mavi Sar
475-495 Yeil-mavi Portakal
495-505 Mavi-yeil Krmz
505-555 Yeil Mor
555-575 Sar-yeil Meneke
575-600 Sar Mavi
600-620 Portakal Yeil-mavi
620-700 Krmz Mavi-yeil
zelti iindeki madde miktarn zeltinin renginden
faydalanarak lme ilemine kolorimetri, bu tip
lmde kullanlan cihazlara da kolorimetre denir.
Kolorimetrik lmde, konsantrasyonu llecek
zeltinin rengi deiik konsantrasyonlardaki
standartlarn rengiyle karlatrlarak deerlendirilir.
Spektroskopik yntemler
Ultraviyole-grnr blge absorpsiyon
spektroskopisi
Floresans ve fosforesans spektroskopisi
Atomik absorpsiyon spektroskopisi
Atomik emisyon ve atomik floresans
spektroskopisi
nfrared (IR)spektroskopisi
Nkleer manyetik rezonans (NMR)
spektroskopisi
Ktle spektrometrisi
Ultraviyole-grnr blge
absorpsiyon spektroskopisi
zelti iindeki madde miktarn zeltiden geen veya
zeltinin tuttuu k miktarndan faydalanarak lme
ilemine fotometri, bu tip lmde kullanlan cihazlara
da fotometre denir.
Fotometrik lmde, renksiz zeltilerin
konsantrasyonu da llebilir.
Analiz edilen rnek zerine k demetinin bir ksmn
filtreler kullanarak ayran ve gnderen aletler
kolorimetre veya fotometre olarak adlandrlrken,
yarklar ya da prizmalar aracl ile bu seicilii yapan
aletler spektrofotometre olarak adlandrlrlar.
Maddenin absorplamasn incelemek iin kullanlan
dzenee absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon
spektrofotometresi ad verilir.
Bir spektrofotometre dzenei, balca k kayna, dalga
boyu seicisi (monokromatr), dedektrden oluur;
dedektrde elektrik sinyaline evrilen optik sinyal bir
kaydedici veya bir galvanometre ile llr.
Ana bileenlere ek olarak spektrofotometrede
toplamak, odaklamak, yanstmak, iki demete blmek, ve
rnek zerine belli bir iddette gndermek amacyla
mercekler, aynalar, k blcleri, giri ve k aralklar
vardr. rnek, kullanlan dalga boyu blgesinde
geiren maddeden yaplm rnek kaplarna (kvet)
konularak k yoluna yerletirilir.
UV-grnr blgede D
2
, W, H
2
, Xe, civa buhar lambas gibi
srekli k kaynaklar kullanlr.
Tungsten flaman lambas, grnr ve yakn IR blgede (320-3000
nm) k yayar. Tungsten lambasnn iinde bir miktar iyot veya
brom buhar bulunursa lambann mr artar ve bu lamba tungsten-
halojen lambas olarak adlandrlr.
Ulraviyole blgede en ok kullanlan lambalar, hidrojen ve
dteryum elektriksel boalm lambalardr. Bu lambalar 180-380
nm arasnda k yayar. Daha pahal ve daha uzun mrl olan D
2

lambasnn yayd n iddeti H
2
lambasna gre ok daha
fazladr.
Xe ark lambas, UV-grnr blgenin tmnde (150-700 nm)
kullanlabilecek iddetli ve srekli k kaynadr.
Civa buhar lambas, her iki blgede ma yapabilen bir k
kaynadr; srekli spektruma ek olarak kesikli hatlar da ierir.
Dalga boyu seicileri (monokromatrler), k
kaynandan gelen polikromatik ktan tek bir dalga
boyunda monokromatik k elde edilmesini gerekletiren
dzeneklerdir.
rnek zerine gnderilen n daha monokromatik
olmasn salamak iin baz spektrofotometrelerde ift
monokromatr kullanlr.
Monokromatr, filtreli
fotometrelerde k
filtresidir;
spektrofotometrelerde
ise k prizmasdr.
Ik filtreleri, camdan yaplm ve uygun boyalarla
boyanm filtrelerdir. Portatif olup kullanc istedii
zaman uygun dalga boyundaki filtreyi cihaza takar.
Filtrelerin zerinde geirdikleri dalga boyu yazldr.
Filtrenin rengi, lm yaplacak zeltinin rengine gre
seilir; rnein, mavi tutan (sar) bir maddenin
lmnde sadece mavi geiren filtre kullanlr.
Ik prizmalar, cam veya kuartz olabilir. zellikle
dk UV nlar iyi geirmediinden cam prizma
grnr blge iin uygundur. Kuartz prizmalar ise hem
UV nlarn iyi geirir, hem de grnr k ve IRe
yakn blgelerde almaya elverilidir. Kuartz prizmalar
pahal spektrofotometrelerde bulunur.
Spektrofotometrelerde dedektr, maddenin
absorplayp absorplamadn anlamak iin k
kaynandan gelen n iddetinin llmesi amacyla
kullanlan dzenektir. UV-grnr blgede kullanlabilen
tr dedektr vardr.
Fotovoltaik dedektrler
Fototp
Fotooaltc tp
Tek k yollu spektrofotometrelerde, bileenlerin tm
ayn k yoluna yerletirilmitir.
Bu aletin balca ayar dmesi vardr: Bunlardan biri, alette
kullanlan optik a veya prizmay mekanik olarak dndrmeyi
salayan dmedir. kinci dme, k yolunu tamamen kapatarak
galvanometre sfr geirgenlik ayarn yapmak iindir. nc
dme, n getii araln enini deitirir.
lmn yaplaca dalga boyu birinci dme ile ayarlandktan
sonra k yolu kapatlarak ikinci dme ile sfr ayar yaplr.
Daha sonra nc dme ile n getii araln eni
deitirilerek ve rnek kabnda sadece zc kullanlarak
galvanometre 100 deerine getirilir. Sfr ve 100 ayarlar her dalga
boyunda yeniden yaplmaldr.
ift k yollu spektrofotometrelerde, monokromatrden
kan k, eit iddette iki demete blnerek biri rnee
dieri sadece zcnn bulunduu kaba gnderilir. kiye
ayrlan k, iki ayr dedektrle alglanr ve dedektrlerde
oluan sinyallerin oran llr. Bylece rnekteki
geirgenlik deeri srekli olarak zcnnki ile
karlatrlm olur. Burada iki dedektrn tam uyumlu
olmas, yani eit iddetteki k ile ayn sinyali oluturmas
gerekir.
ift k yollu spektrofotometrelerde, tek dedektr
kullanlarak da lm yapmak mmkndr.
rnekten ve zcden geen k demetleri dedektr
zerine art arda gelir ve alternatif trden sinyal oluturur.
Ik iddetleri eit ise dedektrde herhangi bir sinyal
olumaz; rnek blmesinden gelen n iddeti
absorpsiyon nedeniyle azald zaman dedektre gelen
sinyal alternatif sinyal olarak alglanr.
ift k yollu spektrofotometrelerin bir baka tr ift
dalga boylu spektrofotometrelerdir. ift dalga boylu
spektrofotometrelerde iki farkl monokromatr vardr; iki
farkl dalga boyundaki k, dnen bir k blc
yardmyla rnekle art arda etkiletirilir.
Bulank zeltilerde dalga boylarndan biri zeltideki
maddenin absorplayaca, dieri ise absorplamayaca
deerlere ayarlanr. Bulanklktan dolay her iki dalga
boyunda ayn miktarda k kayb olacandan iki dalga
boyunda yaplan lmlerin fark, sadece rnein
absorbans ile ilikilidir.
Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin
yaplaca dalga boyunu kararlatrmak iin, rnein
absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun iin,
maddenin 1 molar zeltisinin eitli dalga boylarndaki
absorbans deerleri llr.
zcnn ve zeltide bulunan baka
trlerin absorplamad, Lambert-
Beer eitliine uyulduu ve nicel analizin
en duyarl bir biimde yaplabilecei
dalga boyu deeri saptandktan sonra
analizi yaplacak maddeyi ieren ve
deriimleri bilinen bir dizi standart zelti
ile bu dalga boyundaki absorbans (A)
deerleri llr. A deerleri, standart
zeltilerin bilinen deriimlerine kar
grafie geirilir.
Standart zeltilerin bilinen deriimlerine kar A
deerlerini grafie geirmek suretiyle elde edilen doruya
kalibrasyon dorusu denir.
Nicel analiz, kalibrasyon
dorusunun dorusal olduu
blgede yaplr. Deriimi
bilinmeyen rnein A deeri
llr ve kalibrasyon
dorusunda bu deere karlk
gelen deriim saptanr.
Molar absorpsiyon katsaysnn deerinin bilindii
durumlarda, Lambert-Beer eitliinin analizde dorudan
kullanlmas da mmkndr.
Absorbans (A)=c c l
Spektrofotometrelerde rnein konulduu rnek
kaplar (kvet), yuvarlak bir tp veya drt ke olabilir.
Kvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya
plastikten yaplr.
Soft camlar asidik zeltiler, borosilikat camlar kuvvetli
alkali zeltiler iin uygundur. Corex gibi baz camlar 340
nmde kullanlabilse de ksa UV dalgalar iin uygun
deildir.
Kuartz kvetler hem UV hem grnr dalga boylar iin
uygundur.
Plastik kvetler zel retilmi ise 200-700 nm arasnda
rahatlkla kullanlabilir.
Kvetlerin temizlii:
-Kvetler kullanldktan hemen sonra bol eme suyu ve
ardndan distile sudan geirilmelidir.
-Ar kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduu
kvetler yumuak deterjanl su, eme suyu ve distile su
ile ykanmaldr. Kesinlikle fra kullanmamaldr.
-Deterjanla temizlenemeyen kvetler, %20lik nitrik asitte
bir gece bekletildikten sonra, distile sudan geirilip
kullanlr.
-Kvet temizliinde bikromat solsyonu
kullanlmamaldr. %10luk NaOH kullanlabilir; ancak
kvetler bu zeltide uzun sre kalmamaldr.
Spektrofotometrik lmlerde kr, standart ve
numune olmak zere tp hazrlanr.
Kr, cihazn optik ayarlarnn (sfr ve 100 ayar)
yaplmas amacyla kullanlan zeltidir. Kr zeltisi
olarak distile su veya reaktifin kendisi kullanlr. Baz
lmlerde numune kr de kullanlabilir.
Distile su kr, en sk kullanlan krdr; okuma kvetine
distile su konularak hazrlanr. Daima absorbans deerinin
sfrlanmas iin kullanlr.
Reaktif kr, deneyde kullanlan reaktif ile hazrlanan krdr.
Deneyde birden fazla reaktif varsa birden fazla reaktif kr de
olabilir. Bazen absorbans deerinin sfrlanmas iin, bazen de
distile su krne kar numune gibi kullanlr.
Numune kr, deneyde kullanlan reaktif/numune oranna uygun
olarak distile su veya serum fizyolojik ile numune kartrlarak
hazrlanr. Daima distile su veya reaktif kryle sfrlanm cihazda
numune gibi okutulur.
Numune gibi okutulan reaktif veya numune kr deerleri numune
deerinden karlr.
Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki zeltisidir.
Numune, iindeki madde miktarn tayin etmek istediimiz
zeltidir.
Fotometrik lmler, esas olarak iki tipte yaplr.
Bunlar, end point ve kinetik okumadr.
End point okumada fotometrik okuma, reaksiyon
tamamlandktan sonra yaplr. Bunun iin reaksiyon
karm belli bir sre ve belli bir scaklkta inkbe edilir.
Reaksiyon tamamlanp rnlerin oluumu ve dolaysyla
renk oluumu tamamlandktan sonra okuma yaplr.
A

= c c

l
A
std
= c c
std
l
c

= (A

/ A
std
) c
std

c

= (c
std
/ A
std
) A

= (Faktr) A

Kinetik okumada birim zamandaki absorbans deiimi
llr. Genellikle enzimlerin katalitik aktivitelerinin
tayininde kullanlr. Hesaplama iin deney ortamndaki
kromojen maddenin molar absorpsiyon katsaysnn
bilinmesi gerekir.
Analiz tpne reaktif ve numune konup belirtilen
scaklkta inkbasyona braklr. Deney metodunda
belirtilen bir sre sonra ilk absorbans deerleri okunur.
Daha sonra birer dakika aralarla 2, 3 defa daha absorbans
deerleri okunur ve birbirini takip eden her iki okumann
fark alnr (AA). Daha sonra bu dakikalk absorbans
farklar toplanp okuma aral saysna blnerek
dakikadaki ortalama absorbans deiimi (AA/dakika)
bulunur.
Dakikadaki ortalama absorbans deiimi (AA/dakika),
deneyde llen maddenin miktar reaksiyon srasnda
artyorsa (+), azalyorsa (-) bir saydr; hesaplamada
mutlak deer alnr.
Eer reaktifte deney artlarnda numune olmakszn bir
absorbans deiimi oluyorsa bunun tespit edilip numune
iin bulunan deerden karlmas gerekir. Ayrca AA
deerlerinin birbirinden ok farkl olmas reaksiyonun
lineer olmadn gsterir.
Kinetik okumada sonular, AA/dakika deerleri bir
faktrle arplarak bulunur.
IU/L (mol/dak/L) olarak enzim aktivitesi
hesaplamasnda kullanlan faktr (F):
F = Total volm x 10
6
/ c x k yolu x numune volm
Total volm ml cinsinden deney tpndeki toplam sv
miktar
10
6
sonucu mol/dak/L = IU/Lye evirme katsays
c L/mol/cm cinsinden molar absorpsiyon katsays
(ekstinsiyon katsays)
Ik yolu cm cinsinden okuma kvetinin ap
Numune volm ml cinsinden reaksiyona katlan
numune hacmi
Tercih edilen spektrofotometrik lm cihaznn zellikleri:
-filtreli fotometre deil, spektrofotometre olmal.
-Okuma aral 340-700 nm araln kapsamaldr.
-Cihazn kvet okuma ksm stcl olmaldr.
-Optik okuma iin gerek duyduu asgari reaksiyon hacmi kk olmaldr.
-Cihaz gerekli program bilgilerini hafzasnda tutabilmelidir.
-ebeke elektrik akmndaki dalgalanmalarn zararl etkilerinden korunmak iin bir
reglatr olmaldr.
-ift k yollu cihaz olmaldr.
-Dijital gstergeli ve 0 100 ayarlarn otomatik yapmaldr.
-Hafza sistemi ak olmaldr; test parametreleri kullanc tarafndan
deitirilebilmelidir.
-Bikromatik (ift dalga boylu) okuma yapabilmelidir.
-Dalga boyu geileri kesintisiz olmaldr; her bir nm dalga boyuna ayarlanabilmelidir.
-Cihaz, non-lineer testleri alp hesaplayabilmelidir.
Spektrofotometrelerin kalibrasyonu:
-Bir miktar potasyum bikromat (K
2
Cr
2
O
7
), 100
o
Cde bir
saat sre ile kurutulur.
-Kurutulmu potasyum bikromattan ok hassas olarak
0,005 g tartlr ve 1 Llik balon jojede 0,005 M slfrik
asit zeltisinde son hacim 1 L olacak ekilde zlr.
-Bu zeltinin absorbans, 15-25
o
C aralnda 1 cmlik
kvette 350 nm dalga boyunda okunur. Reaktif kr
olarak 0,005 M slfrik asit zeltisi kullanlr.
-Bu artlarda llen absorbans deeri 0,5360,005
olmaldr.
Otomatik bir spektrofotometre, otoanalizrdr.
Otoanalizr, numune ve reaktifleri uygun llerde alp
kartrr, belirli sre ve sda inkbe eder, gerekli
srelerde optik okumalar yapp sonunda ilgili analiz
sonucunu hesaplanm olarak kullancya sunar.
Trbidimetri ve Nefelometri
Bulankln lm esasna dayanan yntemlerdir.
Trbidimetride, zeltiye gelen k iddetinde
zeltideki partikllerin neden olduu salmadan dolay
ortaya kan k kayb llr. Bunun iin,
absorpsiyonun olmad dalga boyundaki k ve
fotometreler veya kolorimetreler kullanlr.
Trbidimetri, genellikle numunedeki protein yapsndaki
maddelerin lmnde kullanlr. Deiik yntemlerde proteinler
denatre edilerek znrlkleri ortadan kaldrlr; bulanklk
oluturulur ve bu llr. Antikorlarn kullanld deneylere
immnotrbidimetri ad verilir.
Nefelometride, zeltideki partikllerce geli eksenine
gre 90
o
ayla yerletirilmi olan fotosele doru
saptrlan nlar llr. eitli alarda salan nlar
len farkl tip nefelometreler vardr;
spektrofotometreler nefelometri iin kullanlamaz.
nefelometre
trbidimetre
Floresans ve fosforesans
spektroskopisi yntemleri
Bir atom veya moleklde elektronlarn en dk enerjili
orbitallere yerleimi ile atom veya molekln temel
enerji dzeyi veya temel hali oluur. Elektronlarn daha
st enerji dzeylerine yerlemesi ile atom veya
molekln uyarlm hali oluur.
Uyarlm bir atom veya molekl kararszdr; fazla enerjisini atarak
temel hale dnmek ister. Atom veya molekl temel enerji dzeyine
dnerken fazla enerjisinin tmn veya bir ksmn k eklinde
atabilir ve bylece sistemden bir k yaylmas (k emisyonu)
gzlenir. Bu k yaylmas olayna genel olarak lminesans denir.
Uyarlma enerjisi bir kimyasal tepkimeden salanyorsa, bunun
sonucu gzlenen luminesans olayna kemiluminesans ad verilir.
Uyarlma enerjisi elektrot tepkimesinden salanyorsa, bunun
sonucu gzlenen luminesans olayna elektroluminesans veya
elektrokemiluminesans ad verilir.
Biyolojik sistemlerde gzlenen luminesansa biyoluminesans denir.
Uyarlma olay atom veya molekln fotonlar absorplamas sonucu
gerekleiyorsa gzlenen k emisyonuna fotoluminesans denir.
Uyarlm bir singlet sistemden temel haldeki singlet bir
sisteme gei srasnda yaylan a floresans denir.
Uyarlm bir triplet sistemden temel haldeki singlet bir
sisteme gei srasnda yaylan a fosforesans denir.
Uyarlma (eksitasyon) ortadan kalknca floresans olay,
10
-10
-10
-6
s srer; fosforesans ise 10
-6
-10
2
s srer.
Florometride, florometre denilen cihazlarla madde
konsantrasyonu, floresans mann lm ile tayin
edilir.
la analizi, birok organik aktif ila maddesinin
floresans yardmyla yaplabilir.
Metal iyonlarnn analizi, bunlarn oluturduklar baz
floresant kompleksleri yardmyla yaplabilir.
Biyolojik rneklerde baz amino asitler florometrik
yoldan tayin edilebilir.
Baz biyokimyasal bileiklerin florometrik tayini,
bunlarn bir floresant madde ile tepkimeye sokulup yeni
bir floresant rn veya etiketlenmi rn oluturularak
yaplr.
Atomik absorpsiyon
spektroskopisi (AAS)
AAS, n gaz halindeki atomlar tarafndan
absorpsiyonunun llmesi ilkesine dayanr. Bu ilkeye
gre madde konsantrasyonu tayini yapmada kullanlan
cihazlar atomik absorpsiyon spektrofotometreleridir.
I absorplayan atomlar, temel enerji dzeyinden
karasz uyarlm enerji dzeylerine geerler ve
absorpsiyon miktar, temel dzeydeki atom saysna
baldr.
Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinin en nemli
bileenleri, analiz elementinin absorplayaca may
yapan k kayna, rnek zeltisinin atomik buhar
haline getirildii atomlatrc, allan dalga boyunun
dier dalga boylarndan ayrld monokromatr ve k
iddetinin lld dedektrdr.
Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde k
kaynaklar: Oyuk katot lambalar, dk basnta neon
veya argon gibi bir asal gazla doldurulmu silindir
biiminde lambalardr. Katot, oyuk bir silindir eklindedir
ve analiz elementinden yaplmtr. Anot ise tungsten veya
nikelden yaplm bir teldir.
Anot ile katot arasna 100-400 voltluk bir
gerilim uygulandnda lamba iindeki asal
gaz atomlar iyonlar. Oluan iyonlar katoda
arparak yzeydeki metal atomlarn koparr
ve uyarrlar. Uyarlan atomlar temel enerji
dzeyine dnerken katot elementine zg
dalga boyundaki may yayarlar.
Elektrotsuz boalm lambalar, As, Se, Sb gibi uucu ve
kk dalga boylarnda absorpsiyon ve emisyon yapabilen
elementler iin gelitirilmilerdir. Bunlarda 1-2 cm
boyunda ve 5-10 mm apndaki bir kuartz tpe dk
basnta argon gaz ile analiz elementinin 1-2 mg
konmutur; kuartz tpn d eperleri ile temastaki
elektrotlar arasna 200 wattlk bir g uygulama ile
uyarma salanr.
Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde
atomlatrc (absorpsiyon hcresi), rnekteki
iyonlardan ve molekllerden, analizi yaplacak elementin
temel dzeydeki atom buharnn oluturulduu blmdr.
Alevli atomlatrclarda rnek zeltisi aleve haval bir
sisletirici yardm ile pskrtlr.
Alevli atomik absorpsiyon spektrofotometresinde alevin
oluturulmas iin kullanlan yakclar n-kartrmasz ve
n-kartrmal olmak zere iki trdr.
Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde atomlatrc
olarak alev dnda gelitirilen sistemlerin en nemlileri,
elektrotermal atomlatrc olarak da adlandrlan grafit
frnlardr. Bunlar, stlmalar iin ayr bir g kayna
gerektirirler ve daha pahal sistemlerdir. Bunlarda ok
kk rnek hacimleri (5-50 L) yeterlidir ve duyarllk
aleve oranla ok daha fazladr.
Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde
monokromatrn grevi, oyuk katot lambasnn yayd,
incelenen elementin rezonans hattn dier hatlardan
ayrmaktr.
Atomik absorpsiyon spektroskopisinde k sinyalinin
elektrik sinyaline dntrlmesi iin, fotooaltc tpler
kullanlr. Dedektr, alternatif akm sinyaline cevap
verecek ekilde yaplmtr.
Atomik absorpsiyon spektroskopisinde, analizi
yaplacak rnein zelliklerine gre birok
engellemeler ile karlalr.
Kimyasal engellemeler, atomlatrclarda oluan
kimyasal tepkimelerin sonucudur.
yonlama engellemesi, atomlatrcdaki atomlarn
nemli bir miktarnn uygulanan scaklkta iyonlamas
sonucudur.
Spektral engellemeler, atomlatrcdaki iki elementin
veya bir element ile ok atomlu bir trn ayn dalga
boyundaki absorplamas veya yaymas sonucu oluur.
Zemin engellemesi, rnek zeltisinde bulunan ok
atomlu trlerin absorplamasnn sonucudur.
Atomik absorpsiyon spektroskopisi, zellikle eser
miktarlardaki elementlerin nicel analizleri iin ok yaygn
olarak kullanlan bir yntemdir.
Periyodik tablonun IVA, VA ve VIA gruplarnda bulunan
elementlerin oluturduu uucu hidrrlerden yararlanlarak
bu elementlerin AAS yntemi ile analizleri yaplabilir.
Analizi yaplacak elementi AsH
3
, BiH
3
, SbH
3
, H
2
Se, SnH
4
gibi gaz halinde hidrrn oluturarak rnek zeltisinden
ayrmak birok engellemeyi nler.
Atomik emisyon ve atomik
floresans spektroskopisi
Uyarlm enerji dzeyine karlan atomlarn ve tek
atomlu iyonlarn daha dk enerjili dzeylere
geilerinde yaydklar UV-grnr blge masnn
llmesi, yaygn olarak kullanlan bir atomik
spektroskopi ynteminin temelini oluturur. Eer atom
veya iyonlarn uyarlm enerji dzeyine kmalar,
bunlarn UV-grnr blge masn absorplamalar
dnda bir prosesle gereklemise, yaylan mann
llmesi yntemine atomik emisyon spektroskopisi
(AES) ad verilir.
Atomik emisyon spektroskopisi, uyarmay salayan
enerji kaynann trne gre snflandrlr:
Alev emisyon spektroskopisinde, analiz rneini
atomlatrmak ve uyarmak iin alev kullanlr.
Atomlamann ve uyarmann elektriksel boalm veya
plazma gibi bir enerji kayna ile gerekletirildii
yntem, sadece atomik emisyon spektroskopisi veya
optik emisyon spektroskopisi olarak adlandrlr.
Alev emisyon spektrofotometreleri, alev emisyon
spektroskopisi ynteminin de uygulanabilecei ekilde
retilmi atomik absorpsiyon spektrofotometreleridir.
Alev emisyon spektroskopisi ynteminin uyguland
durumda k kayna kullanlmaz.
Sadece alev emisyon spektroskopisi ynteminin
uygulanabilecei ekilde retilen spektrofotometrelere
alev fotometresi (flame fotometre) ad verilir.
Alev fotometresi (flame fotometre) ile analiz iin, alev
zerine zelti ok kk damlacklar halinde (sis
eklinde) pskrtlr. Alevin s etkisiyle, zeltideki
madde atomlarnn elektronlar uyarlr ve bu ekilde
daha st bir enerji seviyesine km olan anstabil
elektronlar daha sonra eski enerji dzeylerine dnerken
aradaki enerji farkn k olarak dar salarlar. Bu k,
zeltideki madde konsantrasyonuyla orantldr ve alev
fotometresinde llr. Rutin laboratuvarlarda bu metod,
Na, K tayininde kullanlr.
Flame fotometrede alev elde etmek iin yakt olarak
genelde metan, btan, propan, asetilen gibi gazlar
kullanlr. Eksitasyon sonucu lityum krmz, sodyum
sar, potasyum meneke renk verir.
Alev emisyon spektroskopisinde karlalan
engellemeler, atomlatrc olarak alevin kullanld
atomik absorpsiyon spektroskopisi ynteminde
karlalan engellemelerin aynsdr. Spektral
engellemelerin nne gemek iin i standart yntemi
kullanlr.
Atomik emisyon spektrofotometrelerinde, analiz
edilecek rnein atomlatrlmas ve uyarlmas iin en
yaygn olarak kullanlan yntem, iki elektrot arasna
elektrik boalm uygulamaktr. Bu yntemde rnek,
elektrotlardan birisinin iine konur ve rnek iermeyen
bir kart elektrotla bu elektrot arasna elektrik boalm
uygulanr.
Atomik emisyon
spektrofotometrelerinde, analiz
edilecek rnein
atomlatrlmas ve uyarlmas
iin son yllarda plazma (gaz
halindeki iyon akm)
kullanlmaktadr. ICP
(Inductively Coupled Plasma)
tekniinde plazma, argon gaz
ile oluturulur.
Atomik emisyon
spektroskopisinde sadece kat
haldeki rneklerin analizi iin
kullanlan atomlatrma ve
uyarma dzenei lazer
mikroprop adn alr. Bu
dzenekte rnek yzeyinde
kk bir alana lazer mas
odaklanarak buharlatrma
ilemi gerekletirilir;
buharlaan rnek, alternatif
akm arknn oluturduu iki
elektrot arasnda uyarlr.
Atomik floresans spektroskopisi (AFS), kesikli veya
srekli bir k kaynandan yaylan mann
absorplanmas ile uyarlm enerji dzeyine kan
atomlarn temel enerji dzeyine dnerken yaydklar
mann llmesi ilkesine dayanan yntemdir.
Yaylan mann absorplanan ma ile ayn dalga
boyunda olduu floresans trne rezonans floresans
denir. Atomik floresans spektroskopisi ynteminde nicel
analiz iin genellikle bu floresans tr kullanlr.
Uyarlm enerji dzeyindeki atomun ma yaparak ilk
uyarld enerji dzeyinden daha yksek enerjili bir
dzeye dnmesi sonucu direkt hat floresans oluur.
Uyarlm enerji dzeyindeki atomun masz yoldan
daha dk bir enerji dzeyine geii ve bu dzeyden
temel dzeye dnerken yayd floresans mas,
basamakl floresans olarak adlandrlr.
Uyarlm enerji dzeyine karlan atom, yksek enerjili
taneciklerle yapt arpmalarla daha yksek enerjili bir
uyarlm dzeye kabilir. Atomun bu uyarlm dzeyden
temel dzeye ya da temel dzeyin stnde bir enerji
dzeyine dnmesi srasnda yaylan floresans masna
termal destekli floresans denir.
Atomik floresans spektrofotometrelerinde, yaylan
floresans masnn iddeti, uyarmay salayan k
kaynana dik bir ada llr.
Floresans sinyalinin ssal olarak oluan emisyon
hatlarndan ayrlmasn salamak iin, k rnee bir k
blc yardm ile ve belirli bir frekansta gnderilir ve
dedektr bu frekansa cevap verecek ekilde ayarlanr.
nfrared (IR)spektroskopisi
Moleklleri oluturan atomlar srekli bir hareket iinde
olduklarndan, molekln teleme hareketleri, bir eksen
etrafnda dnme hareketleri ve bir kimyasal ban
uzunluunun periyodik olarak azalp oalmasna veya
molekldeki alarn periyodik olarak deimesine neden
olan titreim hareketleri doar. Molekllerde ortaya
kan titreimler, gerilme ve eilme hareketlerini
oluturur.
v=0 titreim dzeyinde bulunan ve v frekans ile
titremekte olan bir molekl v=1 ile belirlenen titreim
dzeyine karmak iin, yani titreim enerjisini arttrmak
iin bu molekl titreim frekansna eit frekansa sahip
bir foton ile etkiletirmek gerekir.
Molekllerde titreim enerji dzeyleri arasndaki geileri
gerekletirecek fotonlar, elektromanyetik mann
infrared blgesinde yer alrlar.
Molekller iin infrared absorpsiyon spektrumlar
tanmlanmtr.
Molekllerin infrared absorpsiyon bandlarnda iki blge
tanmlanr. nfrared blgesinin 4000-1000 cm
-1
arasnda
kalan ksm fonksiyonel grup blgesidir; < 1000 cm
-1

blgesi parmak izi blgesidir.
nfrared blgesinin parmak izi blgesinde gzlenen
bandlarn tm incelenen molekle zgdr.
Molekllerin infrared spektrumlar yardmyla yaplarnn
aydnlatlmas bu yntemin en yaygn olarak kullanld
alandr. Bilinmeyen maddelerin infrared spektrumlar,
phenilen maddelerin ayn koullarda ekilen
spektrumlar ile veya katologlarda bulunan spektrumlarla
karlatrlr. Bunun iin kullanlan cihazlar, infrared
absorpsiyon spektrofotometreleridir.
nfrared absorpsiyon spektrofotometrelerinde k kayna
olarak, elektrik akm yardm ile stldklar zaman siyah
cisim mas yapan ve yksek scaklklarda bozunmayan
katlar kullanlr.
nfrared nlarnn iddetinin llmesi, foton
dedektrleri veya ssal dedektrlerle yaplr.
Nkleer manyetik rezonans
(NMR) spektroskopisi
Atomu oluturan ykl taneciklerden elektronlar, kendi
etraflarnda dnerler yani bir spin hareketi yaparlar.
Atom ekirdeklerinin ou da spin hareketi yaparlar.
Atom ekirdeklerinde proton ve ntron saylar ift sayl
ise (
4
He,
12
C,
16
O gibi) bu ekirdeklerin net spini yoktur.
ekirdekteki ntron ve proton saylar tek sayl ise yani
ntron ve proton saylarnn toplam ift sayl ise
ekirdein net spini tam saydr. ekirdekteki ntron veya
proton says tek sayl ise spini yarml deer alr.
Kendi ekseni etrafnda dnen ykl bir parack,
dairesel bir elektrik alan oluturur ve bu akm bir
manyetik alan yaratr.
Spin hareketi yapan ykl bir tanecik, kk bir
mknats gibi davranr ve dolaysyla dtan uygulanan
bir manyetik alandan etkilenir. Manyetik alan iinde
tutulan ykl bir taneciin oluturduu manyetik dipol,
bu alan iinde Lamor dnmesi hareketini yapar.
Manyetik alan etkisinde olan ve spin hareketi yapan ve
net spini olan ekirdek hv enerjisine sahip bir ma ile
etkileirse, bu mann frekans Lamor hareketinin
frekansna eit olduu zaman rezonans koulu
salanm olur ve k absorplanr.
Manyetik alan iinde tutulan bir ekirdein
elektromanyetik may nemli lde absorplamas
iin, rnek ierisindeki bolluu ok olmal ve byk bir
manyetik moment deerine sahip olmaldr. Bu iki
zellii bir arada tayan ekirdekler
1
H,
19
F,
31
Pdur.
Uygun bir radyo dalgas fotonu ile etkiletiinde proton
manyetik rezonansa gireceinden
1
H-NMR yntemiyle
bir rnekte hidrojen atomu olup olmadn anlamak ve
varsa ne kadar hidrojen atomu olduunu lmek
mmkndr.
Farkl kimyasal evreye sahip ekirdeklerin uygulanan
radyo dalgas fotonu ile farkl manyetik alanlarda
rezonansa girmesine kimyasal kayma denir.
Kimyasal kayma deerlerini birbirleri ile
karlatrabilmek ve tablo haline getirebilmek iin
incelenen rnekle beraber bir karlatrma maddesinin de
kullanlmas gerekir.
Sulu olmayan zeltilerde kullanlan karlatrma
maddesi tetrametil silandr [TMS, Si(CH
3
)
4
]. Bu madde,
rnek zeltisine %5 orannda eklenir. Sulu zeltilerde
karlatrma maddesi olarak 2,2-dimetil-2-silapentan-5-
sulfonik asit sodyum tuzu kullanlr.
TMSnin proton rezonansna ait pikin kimyasal kayma
deeri sfr kabul edilir ve teki piklerin kimyasal kayma
deerleri TMSninkine gre verilir. Bu tr kimyasal
lee o lei ad verilir. Bir baka lek olan t
leinde TMSnin kimyasal kayma deeri 10 olarak
alnr.
1
H-NMR,
19
F-NMR,
31
P-NMR spektrometreleri
tasarlanm ve bunlarla eitli maddelerin NMR
spektrumlar elde edilmitir.
Nkleer manyetik rezonans spektrometreleri, numune
sabit frekansta bir elektromanyetik enerjiyle nlanrken,
manyetik alan iddeti srekli olarak deitirilecek ekilde
tasarlanabilir.
Taramal spektrometre ve pulslu spektrometre gibi
NMR spektrometreler vardr.
NMR spektrumlar, daha ok saf haldeki bileiklerin nitel
analizinde ve yaplarnn belirlenmesinde kullanlr.
1
H-
NMR iin, 20-50 mg arlnda rnek 0,5 mL zcde
zlerek 15 cm uzunluunda ve 0,5 cm apnda bir tp
iinde manyetik alana yerletirilir. Nitel analizde
kimyasal kayma deerleri tablolardaki deerlerle
karlatrlr.
NMR spektroskopisi ile nicel analiz de
gerekletirilebilir. Ancak bu amala kullanlrken
yntemin duyarll ok azdr.
Ktle spektrometrisi (MS)
Ktle spektrometrisi ynteminde, atom veya
molekllerden gaz faznda iyonlar oluturulur ve bu iyonlar
ktlelerine gre birbirinden ayrlarak kaydedilir.
yonlarn bal miktarlarnn (ktle/yk) oranlarna gre
izilmi grafiine ktle spektrumu denir.
Bir maddenin ktle spektrumunun elde edilebilmesi iin
bunun nce gaz fazna geirilmesi ve daha sonra
iyonlatrlmas gerekir. rnek nce ktle
spektrometresinin vakum altnda tutulan giri ksmna
gnderilir ve madde gaz faznda deilse, stlarak gaz
fazna gemesi salanr. Gaz haline getirilmi maddenin
moleklleri ince bir delikten difzyon ile iyonlama
blgesine szarlar.
rnein ve uygulamann trne gre eitli iyonlatrma
yntemleri uygulanr. En ok uygulanan iyonlatrma
ynteminde rnek, stlm bir flamandan yaylan ve
elektrik alanndan geirilerek hzlandrlan 50-80 eVluk
bir enerjiye sahip elektron demetiyle bombardman
edilerek iyonlatrlr.
Ktle spektrometresinde iyonlatrma blgesinde elde
edilen iyonlar, elektrikle ykl plakalara doru ekilerek
hzlandrlr ve ktle ayrcsna gnderilir.
Ktle ayrclar, manyetik, uu zamanl, drt kutuplu ve
iyon siklotron rezonansl olmak zere drt trdr. En ok
kullanlan ktle ayrcs, manyetik ayrcdr.
Ktle spektrometresinde ktle ayrcsndan geen iyonlar
dedektr tarafndan alglanr.
Ktle spektrometresinde iyonlar alglamak zere kullanlan
dedektrlerin en basiti, Faraday kabdr. Bu dedektrde bir
iletken kap, spektrometrenin teki ksmlarna gre negatif
bir potansiyelde tutulur ve bylece bu kaba doru ekilen
pozitif ykl iyonlar elektrik akm olutururlar.
Ktle spektrometresinde hem pozitif hem de negatif
iyonlar incelenebilir, ancak pozitif iyonlarn incelenmesi
daha yaygn bir uygulamadr.
Ktle spektrometresinde, belli koullarda elde edilen ve
paralanma rnlerini ieren ktle spektrumu ayn
koullarda elde edilmi spektrumlarla karlatrlarak
molekln nitel analizi yaplr.
Ktle spektrumunda
llen en iddetli pik,
temel pik adn alr ve
bu, paralanma
rnleri iinde en
kararl iyona aittir.
teki piklerin bal
iddetleri bu pike gre
hesaplanr.
Ktle spektrometresinde gzlenen piklerin ykseklii
rnekte bulunan maddenin deriimi ile doru orantl
olduundan bu yntem, nicel analiz amacyla da kullanlr.
Bu yntemle nicel analiz, 10
-9
-10
-6
g gibi ok az rnek
miktar ile ve byk bir duyarlkla yaplr.
Ktle spektrometresi ile, alkoloidler, terpenler, steroidler,
ilalar, petrol rnlerinin nitel ve nicel analizi yaplabilir.
Yntem, adli tpta ve uyuturucu madde analizinde sk
kullanlr.
Gaz haline getirilmesi zor olan veya stlnca bozunmaya
urayan bileiklerin ktle spektrometrik analizi iin
uygulanacak bir yntem, bu bileikleri belli molekllerle
tepkimeye sokarak uucu zellii olan rnlere
evirmektir.