Preparacin de Medios de Cultivo

Medio de cultivo: cualquier material que provea los elementos necesarios para que un organismo se multiplique multiplique.

Los medios de cultivo se utilizan para: separar multiplicar identificar diferenciar mantener organismos etc

Un medio de cultivo debe contener fuentes de: Carbono Nitrgeno Fosfato inorgnico y sulfuro Trazas de metales Agua Vitaminas

Derechos Reservados Laboratorio Microbiologa UPR-RP No usar sin autorizacin

Constituyentes ms comunes en medios de cultivo Constituyente Amino -nitrgeno Factores de crecimientos Fuente de energa Sales amortiguadoras Sales minerales y metales Agentes Selectivos Indicadores Agentes solidificantes Fuente___________________ Peptonas, protenas hidrolisadas, infusiones y extractos Sangre, sueros, extracto de levadura o vitaminas Azcares, alcoholes y carbohidratos Fosfato, acetatos y citrato Fosfato, sulfato, magnesio, calcio, hierro Qumico (sales biliares), antimicrobiales y tintes Rojo fenol, rojo neutral Agar, gelatina

Agar
Polisacrido soluble en agua, extrado del algas marinas de la Clase Rhodophyceae.

El Agar se utiliza en concentraciones de : 1-2% en medio slido.

Las propiedades ms importantes del agar son:

Su transparencia permite identificar el tipo de colonia. Suficientemente fuerte para hacer un estriado pero no tan rgido que afecte las caracterstica de difusin. Solidificacin a 32-40C y se derrite a 85C Libre de pptidos, protenas e hidrocarbonos fermentables Libre de substancias txicas (inhibidores bacteriales) Libre de substancias hemolticas que podran interferir con una reaccin hemlitica normal en un medio de cultivo

0.05-0.5% 0 05 0 5% en medios semislidos observar motilidad 0.1%. crecimiento de anaerobios y microaeroflicos

Bacto Agar recomendado para aplicaciones clnicas, estudios auxotrpicos, estudios de transformaciones de bacteria y levaduras y aplicaciones en gentica-molecular bacteriana . Hojuelas de Agar (Agar Flakes) uso en microbiologa en general Agar Granulado recomendado para crecer cepas de E. coli (HB 101) y Saccharomyces cerevisiae.

Agar Noble estudio de inmunodifusin, algunas aplicaciones en electroforesis

Technical Agar usado para algunas aplicaciones bacteriolgicas generales y no se recomienda para cultivar organismos fastidiosos.

El crecimiento de microorganismos en un medio de cultivo depende de: Nutrientes requeridos y/o apropiados estn disponibles. Oxgeno u otros gases disponibles, segn lo requerido. requerido El medio debe tener el pH apropiado. Humedad Temperatura de incubacin adecuada. Esterilidad del medio. Prevenir la contaminacin.

Descripcin de Medios de Cultivos

Medio qumicamente definido (sinttico); se conoce la composicin qumica y la cantidad exacta de los componentes del medio. medio Medio complejo (no sinttico): contiene ingredientes los cuales su composicin qumica no es conocida, an cuando se conoce la cantidad exacta de sus componentes.

Medio selectivo: permite el crecimiento de algunos organismos mientras inhibe el crecimiento de otros. Medio diferencial : contiene substancias que pueden distinguir un organismo de otro basado en su apariencia ante una reacin qumica.

Medio de Transporte: mantiene temporeramente una muestra hasta llegar al laboratorio para cultivarla. Este medio mantiene la viabilidad de todos los organismo de la muestra sin alterar sus concentraciones. Ej. Stuart's Transport Medium

Medio Enriquecido: medio nutritivo que es suplementado con sangre, suero, o algn factor de crecimiento para promover la multiplicacin de organismos fastidiosos. EJ. TSA con Sangre (Blood Agar)

Preparacin de Medios
Medio Dehidratado e Ingredientes
Se almacenan a una temperatura de 15-30C, en obscuridad y en seco a menos que indique lo contrario. Anote la fecha en que se abri el envase Revise la fecha de expiracin Verifique que las caractersticas fsicas del medio son las correctas

 Cristalera o Plsticos
Utilice cristal de borosilicato de alta calidad y low alkali. Evite residuo de detergente . Revise si hay residuos alkalinos o cidos con unas gotas de bromotimol azul, indicador de pH (amarillo-cido; azul-alkalino) Utilice matraz de por lo menos 2-3 veces el volumen del medio Descarte la cristalera demasiada reciclada o de baja calidad No utilice cristalera rota o estillada

Equipo Balanzas, metro de pH, autoclaves y otros equipos deben ser frecuentemente calibrado o validados.

Agua Use agua destilada o deionizada pH 5.5-7.5

Disolver el Medio Calcule la cantidad exacta de medio que necesita. Disuelva el medio completamente Agite el medio mientras se disuelve. Aquellos medios que se calienta, tenga cuidado de no sobre calentar. Algunos medios son bien sensitivos al sobre calentamiento No se calienta en calentamiento. el microondas. Ajuste el pH Dispense el medio en la cristalera correspondiente

 Esterilizacin
Temperatura del autoclave 121 C Mantenimiento del autoclave es importante (monitoreo) Se recomienda 15 min. de esterilizacin asumiendo que el volmen del medio es de un litro o menor. Volumenes ms grandes requieren un ciclo ms prolongado. Debe consultar con el manufacturero el tiempo para volumenes mayores. Ciclo de esterilizacin prolongada puede causar cambios en la concentracin y la generacin de sustancias inhibitorias

Aadir Enriquecedores y Suplementos

Enriquecedores y suplementos tienden hacer sensitivos al calor. Enfrie el medio a 45-50C en un bao serolgico antes de aadir el enriquecedor y el suplemento. Asegrese de que el medio basal y los aditivos se mezclen bien. Los caldos estriles deben dejarse enfriar a temperatura ambiente antes de agregarles los aditivos.

pH
El pH tiende a descender 0.2 unidades durante la esterilizacin . Evite ajuste excesivo de pH.

Dispensar medios Enfre el medio a 50-55C para reducir la evaporacin de agua. Mantenga mezclando el medio durante el vertido. Vierta rpidamente. rpidamente Deje de 10-15 mins la tapa de la placa Petri ligeramente abierta para obtener una superficie seca( esto debe hacerce en un "Biological Safety Cabinet" para evitar que se contaminen las placas).

Almacenaje del Medio Preparado Todo medio de cultivo preparado debe ser rotulado con; el nombre del medio , la fecha cuando se prepar .o seguir el protocolo del laboratorio o la agencia en cual trabaja. En general, las placas vertidas con medio, deben guardarse invertidas en una bolsa plstica u otro container en el refrigerador , en oscuridad por 1-2 semanas. Las mayora de los medios en tubos o matraces pueden almacenarce por mas tiempo en el refrigerador siempre y cuando esten bien sellado. Siempre deben consultar con las guias del medio para saber el tiempo que pueden estar almacenado ,

 Control de calidad del Medio Cada lote de medio que se prepara debe ser probado.
Inocule placa o tubo con un organismo control positivo y otro con un control negativo. Los organismos a utilizarce como controles los puede obtener en el M bt l Manual o G i d l M l Guia del Manufacturero . f t Debe incubar un tubo o una placa con el medio para probar su esterilidad.

Debe mantenerse record del medio . Reportar deficiencia del medio al manufacturero