Microbiología de los suelos y Azospirillum

MICROBIOLOGA DE LOS SUELOS
Gnero: Azospirillum
I.
INTRODUCCIN:
El suelo es una fuente rica de minerales y nutrientes que la planta necesita para poder subsistir, desde hace miles de aos los microorganismos presentes en el suelo empezaron a generar nutrientes y enzimas que favorecan al crecimiento de las plantas, estos microorganismos benficos formaron simbiosis con las plantas o las plantas se adaptaron a ellos. Adems cumplen un rol fundamental en el mantenimiento del ecosistema. Los microorganismos presentes en el suelo ejercen una accin especfica cuando se relacionan con una especie vegetal. El estudio de la relacin microorganismo-planta es muy importante ya que permite establecer una relacin entre el tipo de suelo, la variedad de planta y la micro-biota asociada. Estas interacciones naturales dependen en gran parte del correcto mantenimiento de los ciclos biolgicos que se realicen a este nivel (sistema radicular). El suelo es un substrato imprescindible de la vida en el medio terrestre, pues en el se encuentran los macronutrientes como el nitrgeno, carbono, hidrogeno y oxigeno, los cuales son los componentes principales de protenas, coenzimas, nucletidos y clorofila. Estos macronutrientes y las fitohormonas reguladoras del crecimiento desempean un rol importante en el desarrollo vegetativo y rendimientos de cultivos. Hoy en da se ve la necesidad de fertilizar los suelos por el desgaste que han ido sufriendo durante todos los aos que la agricultura mal organizada y mal practicada ha sido empleada por las personas, en la obtencin de alimentos. Frente a esta necesidad de suelos infrtiles con bajo ndice de nitrgeno, se emplea fertilizantes qumicos, sin embargo estos no son muy aprovechados por la planta o cultivos, y aproximadamente un 67% se pierde, quedando un exceso de compuestos nitrogenados en el ecosistema que representan la mayor fuente de cintaminacion e la atmosfera (oxido de nitrgeno) y en las aguas superficiales y profundas (nitratos) (Collados, 2006).
Azospirillum spp.
Esp. Microbiologa y Parasitologa.

Como una alternativa al uso de fertilizantes qumicos y reguladores sintticos del crecimiento vegetal, se emplean microorganismos presentes en el suelo como Azospirillum spp., que incrementa la fertilidad natural de suelo y benefician el desarrollo vegetal a travs de diferentes mecanismos como la fijacin no simbitica de nitrgeno y proteccin frente al ataque de plagas y patgenos. Se considera a Azospirillum spp. como uno de los gneros de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal ms estudiados en la actualidad debido a su capacidad de mejorar significativamente el crecimiento y desarrollo, as como el rendimiento de numerosas especies vegetales de inters agrcola (Bashan et al. 2004). Uno de los principales mecanismos propuestos en la actualidad para explicar la promocin del crecimiento vegetal en plantas inoculadas con Azospirillum sp., se relaciona con su capacidad de producir y metabolizar compuestos reguladores del crecimiento vegetal o fitohormonas (Okon and Labandera Gonzles 1994). II.
MARCO TERICO:
A. Historia de Azospirillum spp.
En un principio fue llamado Spirillum lipoferum que fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias dcadas. Son las observaciones de Pea-Cabriales y Dbereiner en 1973 las que iniciaran la poca moderna de esta bacteria. Estudios taxonmicos de S. lipoferum conducen a su reclasificacin en un gnero nuevo, Azospirillum. Actualmente son reconocidas seis especies en el gnero Azospirillum. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo stas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largomobile siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile. Pocos aos despus del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este gnero fue el ms estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovi
Azospirillum spp.

numerosos estudios sobre la ecologa, fisiologa y gentica de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial comienza a extenderse en diferentes pases.
B. Caractersticas Culturales
Caractersticas Generales: El genero Azospirillum es una proteobactria, Gram negativa que utiliza como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminocidos y nitrgeno molecular. Tiene forma bacilar pleomorfica, se puede apreciar en algunas cepas la forma de C, con un dimetro de 0.8 a 1 um de largo y 2 a 4 um de ancho. Tienen una cantidad de G+C equivalente al 68% a 70%. Son
microaerofilos, presentan movilidad en espiral por flagelos peritricos o polares. Habitan comnmente en el suelo y rizosfera, asociado a plantas, tiene la capacidad de fijar el N. Almacena como reserva poli-B-hidroxibutirato, observndose al microscopio las clulas jvenes con abundantes grnulos refringentes.
Fig. 1 Microscopia electrnica de Azozpirillum spp. Caractersticas Diferenciales Requiere una T optima de crecimiento de 30C a 32C, un pH de 7.0 7.3 (neutro), presenta la enzima oxidasa (oxidasa +), para su cultivo requiere de biotina. En el medio Nfb semislido desarrolla una pelcula blanquecina y
Azospirillum spp. Esp. Microbiologa y Parasitologa.

densa debajo dela superficie (3 a 5mm), con viraje del indicador al azul; en medio Nfb solido se desarrollan colonias circulares, planas blanquecinas de 2 a 3 mm, con superficies lisas o rugosas y bordes enteros, con viraje del verde al azul.
Fig. 2- Placas con medio Nfb (solido). A la izquierda de color verde claro una placa con medio Nfb sin inoculacin de Azospirillum. A la derecha placa de medio Nfb con colonias blanquecinas y con el viraje a color azul. En cultivos semigelificados y gelificados con ms de 24 h de incubacin se presentan frecuentemente clulas refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas similares a quistes.
Fig. 3.-Formacin de "velo" a 5 mm de la superficie en medio semi-solido selectivo para Azospirillum"
Azospirillum spp.

Una de las caractersticas fenotpicas ms ampliamente usada como criterio para el reconocimiento tentativo del gnero Azospirillum es el color rojo escarlata que toman las colonias al crecer en un medio adicionado del colorante rojo Congo.
Fig.4--Colonias Rojo escarlata de Azospirillum en placa con medio rojo de congo con acido malico. Azospirillum presenta quimiotaxis positiva hacia cidos orgnicos, azucares, aminocidos, compuestos aromticos y hacia exudados radicales (Crozier et at 1988; Lpez de Victoria y Lovell, 1993). Este genero migra hacia lugares del suelo donde la concentracin de oxigeno es la adecuada ubicndose en nichos ecolgicos apropiados en la rizosfera donde realiza la fijacin biolgica del nitrgeno y sintetiza sustancias estimuladoras del crecimiento.
C. Clasificacin:
La clasificacin del Genero Azospirillum spp. Se realizo en funcin de las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas segn el Manual de Bergey: Reino: Bacteria

Phylum: Proteobacteria Clase: Alpha Proteobacteria Orden: Rhodospirillales Familia: Rhodospirillaceae Genero: Azospirillu Especies: A. amazonense, A. halopraederans, A. lipoferum, A. brasilienses.
D. Aislamiento de Azospirillum:
1. Zona de recoleccin de muestreo: Azospieillum spp. Tiene como habitad el suelo de cultivos, especficamente en la zona denominada rizosfera, en cultivos de Tomate (Lycopersicon sculentus) o de Maiz (Zea mays). 2. Obtencin de muestras de races: se recolectan las races del tomate o maz, al final del ciclo vegetativo aproximadamente un mes antes de la cosecha. Luego se lavan las races con agua potable, hasta eliminar el suelo remanente. Se cortan en secciones de
aproximadamente 5 cm, luego se desinfectan con hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 %, durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces consecutivas con agua destilada estril. Luego se cortaron en secciones de un tamao aproximado de 2 cm de longitud y se enjuagaron con agua destilada estril. 3. Enriquecimiento: Para favorecer el crecimiento de bacterias fijadoras de nitrgeno, se realiza el enriquecimiento de cada una de las muestras, depositando las races de 10 a 15 mm por debajo de la superficie en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido. Se incuba en aerobiosis a 30 C por 5 das. Resultados: Tubos con viraje del color verde asta azul, con una pelcula blanquecina de 3 a 5 mm. 4. Aislamiento Primario: se seleccionan los tubos donde se observa viraje del color verde del medio hacia el azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se

toma una alcuota de la pelcula, con la que se obtiene una suspensin en 1 mL de solucin salina fisiolgica estril, y se siembra por agotamiento y estra en placas de Petri con medio Nfb slido con 20 mgL-1 de extracto de levadura. Incubar a 30 C durante 3 a 5 das. Resultados: desarrollaran colonias blanquecinas y pequeas con viraje del verde al azul de 2 a 3mm. 5. Identificacin primaria de la Bacteria: seleccionamos una colonia aislada y se realiza la tincin Gram y observar que no este contaminada la muestra. Resultado: bacilos Gram negativos (-). 6. Cultivo puro: de la colonia que se realiza la tincin Gram, cogemos con el ansa en punta un poco de la colonia y la sembramos en un vial con agar nutritivo por el mtodo de estriado Resultados: se obtendr una estra uniforme con una sola caracterstica para todas las colonias. Para confirmar que no este contaminada el cultivo puro se realiza una tincin Gram. 7. Identificacin Bioqumica de la bacteria: Oxidasa: oxidasa +
Medio Nfb semislido: las placas Petri se incuban
en
aerobiosis a 30 C por 1 semana. Luego se observara el viraje de verde asta azul, lo que comprueba que se trata del genero Azospirullim spp.
Medio agar rojo de Congo: las Placas de Petri se incuban a

30 C por 48 a 72 h. Luego se observaran las colonias de color rojo escarlata. Lo que nos confirma q se trata del genero Azospirillum.
8. Identificacion Molecular: Prueba de PCR: la identificacin genotpica rutinaria de

las especies de Azospirillum, as como su deteccin, se logra fcilmente y en forma reproducible amplificando mediante el

uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de los oligonuclotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los productos amplificados con la enzima de restriccin AluI. Con esta estrategia se obtienen fragmentos de tamaos especficos para cada especie de Azospirillum, distinguibles fcilmente en geles de agarosa.
FLUJO-GRAMA PARA LA IDENTIFICACIN DE CEPAS DE Azospirillum

Races de Tomate o Maz
Lavar con agua potable y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2% x 5min
Cortar las races en trozos de 5 cm, enjuagarlas 2 veces y volver a cortar en 2 cm
Enriquecer en medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido (6ml)
Incubar Por 5 dias a 30C
Incubar de 3 a 5 dias a 30C
Sembrar en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido
Azospirillum spp.
Cultivo puro primario en vial con agar nutritivo
Pruebas Bioquimicas
E. Importancia de Azozpirillum:
Las especies microbianas del genero Azospirillum son muy importantes ya que favorecen el crecimiento de la planta lo cual ha sido relacionado con el metabolismo del nitrgeno, a travs de la fijacin biolgica en condiciones de vida libre o por el incremento de la actividad nitrato reductasa en condiciones endofficas, con relacin al metabolismo del nitrgeno, Azospirillum adems de fijar el nitrgeno atmosfrico en condiciones de microaerofilia que lo asimila como amonio, presenta reduccin asimilatoria del nitrato en condiciones aerbicas. Cuando Azospirillum crece en condiciones anaerbicas utiliza el nitrato como ltimo aceptor de electrones provocando denitrificacion:
NO3-
NO2-
(NO)
N2O
N2
Azospirillum presenta una nitrogenasa constituida de una ferroprotena y una molibdoferroprotena que reduce el observado que la presencia N2 a (NH 4+). S e de sales de ha
amonio
(NH4+) inhibe la actividad de la nitrogenasa
Azospirillum spp.

Glutamino sintetasa (GS), glutamato deshidrogenasa (GDH-NADH) y glutamato sintetasa (GOGAT- NADPH) las cuales incorporan el nitrgeno fijado a la ruta de biosntesis de a.a., pptidos y protena. El inters agronmico por dicho gnero se basa en los beneficios potenciales que presentan algunas cepas para ser utilizadas como biofertilizante. relacionado con la capacidad de este microorganismo para producir o metabolizar compuestos del tipo fitohormonas, tales como cido indol actico; citocininas (Tien et al. 1979); giberelinas (Bottini et al. 1989) y etileno (Strzelczyk et al. 1994), as como de otras molculas reguladoras del crecimiento vegetal, tales como el cido abscsico (ABA)
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F. Ambiente rizosfrico:
Aparentemente, una bacteria del suelo deber sobrevivir a las mltiples interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interaccin con las races de la planta. En el inicio de una interaccin con las races de la planta hospedera, el microorganismo especfico deber llegar a la superficie de las races, adherirse y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los tejidos internos, se diseminar en el interior de la raz e incluso en otros rganos de la planta. La adaptacin de Azospirillum al futuro ambiente rizosfrico probablemente se inicia con la germinacin de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos orgnicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudacin de compuestos ser a travs de las races durante el desarrollo de la planta. Aun cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrgeno, estas bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacridos as como alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos cidos orgnicos tales como mlico y succnico y algunos aminocidos. Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las

enzimas de la va de Embden-Meyerhof-Parnas y de la va de Entner-Doudoroff, as como todas las enzimas del ciclo de los cidos Tricarboxlicos. Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotrficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa La riqueza en compuestos orgnicos en la espermosfera/rizosfera conduce a intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la quimiotaxis a los exudados de raz es uno de los factores que influyen en la llegada de los microorganismos a la rizosfera. Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se demostr una fuerte actividad quimiotctica hacia diversos azcares, cidos orgnicos y aminocidos, as como hacia compuestos aromticos y exudados radicales. La respuesta quimiotctica a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de la especie de Azospirillum e incluso es cepa-especfica. Tambin una respuesta hacia el oxgeno (aerotaxis) fue observada en A. brasilense. Zonas de baja concentracin en oxgeno fueron las preferidas por las clulas bacterianas para su crecimiento y multiplicacin, siendo repelidas por altas concentraciones de oxgeno y condiciones anaerbicas. La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijacin de nitrgeno, permitindole a las clulas de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxgeno lo suficientemente bajas para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y aerotctica son caractersticas que contribuyen en el proceso de colonizacin de las races de las plantas, ya que el consumo de oxgeno durante el crecimiento activo de las races enriquece el ambiente con sustratos orgnicos y genera gradientes de oxgeno al consumirse ste durante la respiracin. No obstante, la colonizacin de la rizosfera y la superficie o el interior de las races ser el resultado del enriquecimiento selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la capacidad para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A. lipoferum podra representar ventajas competitivas sobre las cepas de estas especies o ntimamente relacionadas que sean sensibles a estas biomolculas. Adems, la capacidad de producir siderforos (agentes quelantes del hierro) por algunas cepas de A. brasilense pudiera ser de gran
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importancia durante la colonizacin del ambiente rizosfrico y de la superficie de las races al ejercer efectos antagnicos contra otros miembros de la comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletreos o patgenos de las plantas.
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Fiq. 5. Inhibicion del crecimiento y la esporulacion de un hongo fitopatogeno causada por A. brasilense.
Esta actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los antibiticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol producidos por actinomicetos del suelo, en comparacin a la elevada resistencia a los antibiticos del tipo -lactmicos producidos por hongos. La expresin constitutiva de la actividad -lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense. Estos resultados sugieren que el antagonismo causado por hongos contra Azospirillum es limitado. Tambin es concebible que se presenten efectos sinrgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad rizosfrica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola, hongo usado como agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A. lipoferum y A. brasilense. De manera similar, la interaccin entre A.

brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilis conduce a
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incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo. Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de metales pesados provocan que las clulas vibroides de Azospirillum cambien su morfologa y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C), conduciendo a la agregacin celular y formando grumos visibles de gran tamao. Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacrido y en el polisacrido capsular estn involucrados en la agregacin de A. brasilense. La agregacin y la formacin de quistes mejoran la sobrevivencia de Azospirillum, situacin en la que la acumulacin de poli--hidroxibutirato (PHB) parece desempear una funcin importante al servir como almacn de carbono y energa. Adems, diversas funciones fisiolgicas son atribuidas al PHB, destacndose la mayor resistencia a la desecacin, a la luz ultravioleta y al choque osmtico. Se ha sugerido que la formacin de quistes pudiera desempear una funcin importante en la sobrevivencia de Azospirillum en el ambiente rizosfrico, cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociacin con las races de la planta. Recientemente, ha sido publicada una amplia revisin sobre las caractersticas de A. brasilense en relacin con la agregacin celular.
G. Interaccin con la planta:

Probablemente, una vez que las clulas de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente rizosfrico y han logrado llegar a la superficie de las races, debido a sus caractersticas quimio y aerotcticas, se iniciar el establecimiento de la asociacin. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para adherirse a las races de plantas gramneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens, trigo, maz, as como a las races de plantas de otras familias que incluyen al algodn y tomate, e incluso a superficies inertes como poliestireno y arena. La capacidad de Azospirillum para adherirse a las races, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad

rizosfera como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso
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que E. coli. La asociacin de Azospirillum con las races de las plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes. La primera consiste en una adsorcin rpida, dbil y reversible, la cual es dependiente de protenas de la superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en conjunto con la participacin del flagelo polar. La segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su mximo nivel 16 h despus de la inoculacin, el cual parece ser dependiente de un polisacrido extracelular de Azospirillum. Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una protena de la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las races de las plantas. El proceso de adherencia de Azospirillum a las races de las plantas ha sido revisado recientemente. En diversos casos se ha reportado la aparicin de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las races de diversas plantas, describindose como esencial para el anclaje a las partculas de arena. An en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido elucidada, aunque parece ser de origen bacteriano. Recientemente se ha publicado una revisin sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a superficies abiticas del suelo. La inoculacin de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonizacin son las reas de elongacin celular y las bases de los pelos radicales. Slo algunas clulas de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. La inoculacin de races de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostr que en los primeros das de la asociacin las clulas bacterianas colonizan especficamente los sitios de emergencia de las races laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raz primaria como de las races secundarias y posteriormente la superficie de la raz. En plantas de trigo fue observado que la inoculacin de Azospirillum induce cambios en la morfologa de los pelos radicales, siendo stos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter

chrococcum, los cuales son mnimos. Adems, fue observado que la inoculacin con 105 a 106 clulas de Azospirillum causa tanto la elongacin como el aumento de la superficie total de la raz, en tanto que la inoculacin de 108 a 109 clulas causa la inhibicin del desarrollo de sta. Aparentemente, el incremento del tamao del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la divisin celular y al intenso crecimiento de la zona de elongacin de las races. Es de inters sealar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz. La capacidad de Azospirillum para colonizar las races de las plantas es variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia con focal de rayos lser y sondas de oligonucletidos fluorescentes y con el uso de anticuerpos monoclonales cepa-especficos ha sido mostrado que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente rizosfrico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raz de plntulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas densidades en los espacios intercelulares de la raz, as como en el interior de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologas, haban sido reportados con algunas de las mismas cepas
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de Azospirillum inoculadas en trigo creciendo en condiciones de campo.
Azospirillum spp.
Fig. 5. Estimulacin del crecimiento de las races de maz inocuilado con A. brasilensis
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Azospirillum spp.

H.
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Mecanismos de estimulacin del crecimiento de las plantas:
Auxinas
Tiene la capacidad de inducir la elongacin de las clulas del tallo en la regin subapical y que logran reproducir el efecto fisiolgico del cido indol 3actico (AIA). Estos compuestos han sido vinculados a procesos de
orientacin del crecimiento de tallos y races en respuesta a la luz y gravedad, diferenciacin de tejidos vasculares, dominancia apical, iniciacin de las races laterales y adventicias, estimulacin de la divisin celular y elongacin de tallos y races (Ross et al. 2000). La produccin y metabolismo bacteriano de auxinas ha captado la atencin de los investigadores desde dos puntos de vista: a nivel metablico, por la capacidad del microorganismo para producir estos compuestos y regular su produccin en diferentes condiciones ambientales (Costacurta and Vanderleyden 1995) y a nivel morfofisiolgico por el efecto que ocasiona su produccin en asociacin con distintas especies vegetales (Falik et al. 1989). En cultivos puros de Azospirillum sp., adems de la forma principal, el cido indol3-actico (AIA), se han identificado otros compuestos indlicos de inters, tales como el cido indol-butrico (IBA) (Costacurta et al. 1994), indol lctico (Crozier et al. 1988), indol acetamida (Hartmann et al. 1983), indol acetaldehdo (Costacurta et al. 1994), indol etanol e indol metanol (Crozier et al. 1988), triptamina, antranilato y otros compuestos indlicos no caracterizados an (Hartmann et al. 1983).
Biosntesis bacteriana de auxinas

En microorganismos se han propuesto, al menos tres vas metablicas para la biosntesis del cido indol actico (AIA) a partir de triptofano (Trp), denominadas va del indol 3-piruvico (AIP), cido 3-acetamida (AIM) y la va de la triptamina (Tam) (Cheryl and Glick 1996). Adicionalmente se ha descripto una va que no requiere de este precursor para la biosntesis del AIA y que se denominada va independiente del Trp. A pesar de esta diversidad, en el metabolismo procaritico la biosntesis parece seguir dos rutas predominates: la

ruta de la indol 3-acetamida (IAM) y la del cido indol 3- pirvico (IPA) por encima de la va de la triptamina (Tam) y de la va independiente de triptofano. Lambrecht et al. (2000) han encontrado un patrn de biosntesis de AIA caracterstico de la interaccin planta-microorganismo que depende
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especficamente de rol ecofisiolgico de la especie bacteriana que interacta, siendo estas fitopatognicas o promotoras del crecimiento. Tal es el caso de Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas
savastanoi y Erwinia herbicola, todas especies fitopatognicas que sintetizan el AIA de manera inducible por la va de la indol 3- acetamida (IAM) y de manera constitutiva por la va del indol 3-piruvico (IPA). La expresin del gen clave de la va de la indol acetamida (iaaM), es predominante cuando la bacteria se encuentra en el apoplasto vegetal en forma invasiva, mientras que la expresin del gen clave de la va del indol 3- piruvico (ipdC) es predominante cuando la bacteria se encuentra en la superficie de la hoja de manera saproftica. En contrapartida, la mayor parte de las bacterias promotoras del crecimiento, tales como Azospirillum sp. o Bacillus sp. Sintetizan AIA de manera inducible a travs de la va del IPA (Patten and Glick 1996). Abdel-Salam and Klingmller (1987) lograron aislar once mutantes (Tn-5) de Azospirillum lipoferum capaces de producir entre el 45-90% menos de AIA, comparados con sus cepas isognicas salvajes. La capacidad residual de estos mutantes, sugiri en ese momento dos explicaciones posibles: la existencia de varias rutas de sntesis de AIA la presencia de mltiples copias de genes codificantes de transferasas de aminocidos aromticos con baja especificidad por el sustrato. En la actualidad sabemos que al menos cuatro vas de sntesis diferentes han sido descriptas para el gnero Azospirillum (Prinsen et al. 1993), tres dependientes del Trp: Indol 3pirutato (AIP), Indol 3-acetamida (AIM) y Triptamina (Tam) y una que no utilizara a este aminocido como precursor (Costacurta and Vanderleyden 1995). La magnitud de expresin de cada va depende fundamentalmente de las condiciones de crecimiento bacteriano y en general se considera que la sntesis mayoritaria depende de la disponibilidad del Trp en el sustrato. En este sentido, la evidencia establece que si el aminocido se encuentra disponible, la va

predominante es la del acido indol-3-piruvico (IPA) y de manera secundaria la va de la de la indol 3-acetamida (IAM). La va del cido indol 3-pirvico (AIP) parece tener gran homologa a la descripta en plantas superiores (Nonhebel 1993) y su secuencia comienza con la conversin del Trp a AIP por una transferasa de aminocidos aromticos, seguida por decarboxilacin del producto a indol 3acetaldehdo, a cargo de una indol piruvato decarboxilasa y posterior oxidacin a AIA por una indolacetaldehdo dehidrogenasa (Costacurta et al. 1994). La va del IPA fue confirmada inicialmente en A. brasilense Sp245 cuando se clon por primera vez el gen ipdC que codifica para una IPyA decarboxilasa (Costacurta et al. 1994). La posterior caracterizacin molecular descripta por Van de Broek et al. (1999), determin que la expresin de este gen era regulada corriente arriba por el mismo IAA, lo cual represent la primera descripcin de un gen bacteriano especificamente regulado por auxinas. El promotor del gen ipdC contiene un elemento de respuesta a auxinas (AuxRE), el cual es similar al AuxRE encontrado en los promotores de los genes inducibles por auxinas de plantas superiores (Lambretch et al. 1999). Por su parte, la va de la indol 3-acetamida (IAM) ha sido una de las ms estudiadas en bacterias fundamentalmente fitopatognicas e involucra la accin consecutiva de dos grupos de enzimas: Trp-monooxigenasas responsables de la oxidacin del Trp a indol 3-acetamida y AIM-hidrolasas responsables de la subsecuente hidrolisis del precursor a AIA, y para las que sendos genes ya han sido clonados en Pseudomonas syringae (Yamada et al. 1985) y Agrobacterium tumefaciens (Klee et al. 1984). La existencia de esta va en A. brasilense fue sugerida en los trabajos de Prinsen et al. (1993) y en los ensayos de Bar and Okon (1993). Posteriormente, en ensayos realizados con varias cepas de A. brasilense y mutantes con reducida capacidad de sintetizar AIA, en medio de cultivo qumicamente definido, Prisen et al. (1993), determinaron la existencia de Indol 3-acetamida en la fraccin sobrenadante del medio de crecimiento, con lo que se presentaba evidencia directa de la capacidad bacteriana de sntetizar este precursor. Una tercera va de menor importancia ha sido descripta para este gnero, la va de la Triptamina, en la que los eventos bioqumicos involucran la
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conversin inicial del Trp a triptamina, catalizada por enzimas tipo Trpdecarboxilasas dependientes del piroxidal fosfato, seguida de la conversin a indolacetaldehdo por aminaoxidasas. Aunque esta va esta presente en plantas (Conney and Nonhebel 1991) y hongos (Frankenberger and Arshad 1995) se ha puesto muy poca atencin en bacterias y solo fue sugerida para dos especies en particular. Bacillus cereus (Perley and Stowe 1996) y Azospirillum brasilense (Hartman et al. 1983), quienes comprobaron la capacidad bacteriana de producir AIA a partir de triptamina en medio de cultivo qumicamente definido. Posteriormente, Ruckdschel and Klingmller (1992) detectaron compuestos intermediarios y confirmaron esta va de sntesis en sobrenadantes de cultivos de Azospirillum lipoferum. Desde el punto de vista molecular, ni las enzimas, ni los genes de la va han sido caracterizados para este gnero. Finalmente se ha descripto una va independiente del Trp en la que trabajando con precursores metablicos marcados, Prinsen et al. (1993) sugirieron que la conversin de AIA (en ausencia de Trp) en diferentes cepas de Azospirillum brasilense segua una distribucin del 0,1; 10; y 90% para las vas de la IAM, AIP y la Independiente del Trp respectivamente; sin embargo, esta va habra sido desestimada recientemente para este microorganismo y solo se consideraran aquellas dependientes del Trp (Yaacov Okon)
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Giberelinas
Las giberelinas (GAs) constituyen un amplio grupo de compuestos naturales (cidos diterpenos tetracclicos) que regulan diversos procesos en el crecimiento y desarrollo de las plantas, tales como la germinacin, el alargamiento caulinar, la floracin y la fructificacin (Davies 1995). Desde el punto de vista estructural, las giberelinas libres se dividen en dos grandes grupos: aquellas que poseen un complemento completo de tomos de carbono, (GAs-C20) y aquellas en las que el C20 se pierde (GAs-C19). Todas las GAs estn carboxiladas en el C7, con la excepcin de GA12-aldehdo y pueden tener presentes una (GA4), dos (GA1), tres (GA8) cuatro (GA32) funciones hidroxilo. La posicin en la molcula que presenta hidroxilacin (OH), representa unos de los puntos ms importantes en la determinacin de la

actividad biolgica. As, la hidroxilacin de los C3 y C13 en sus posiciones y respectivamente, produce la activacin de la molcula, mientras que la hidroxilacin del C2 en su posicin tiene efecto fuertemente negativo sobre su actividad biolgica (Pearce et al. 1994). Adems de las formas libres, se han identificado formas conjugadas endgenas que incluyen: ter glucosdicos (GAG), donde la glucosa se une a la estructura de la GA por un grupo hidroxlo, y los steres glucosdicos (GA-GE), donde la glucosa se une a la molcula de la hormona por medio de un grupo carboxlo del C7 (Sembder et al. 1968).
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Biosntesis y Metabolismo
Las GAs pueden definirse como productos de la va de los diterpenos y su sntesis, en plantas superiores se inicia con la ciclizacin de un precursor comn de 20 molculas de carbono, el geranil geranil pirofosfato (GGPP). Este intermediario es sintetizado en plstidos a partir de cido mevalnico (AM), isopentenil difosfato proveniente de gliceraldehdo 3-fosfato bien como se comprob recientemente por piruvato proveniente de la va de las deoxixulosas 5-fosfato (Litchtenthaler, 1999). En tejidos de crecimiento vegetativo, ocurre la primera fase de sntesis, con la ciclizacin del GGPP en protoplstidos y resulta en la formacin definitiva del ent-kaureno, en dos pasos sucesivos que requieren de la actividad de dos enzimas claves: la copalil difosfato sintasa (CPS), la cual produce el intermediario copalil difosfato y la ent-kaureno sintasa, que sintetiza el producto final ent-kaureno. En una segunda fase de sntesis, el ent-kaureno es convertido en Gas biolgicamente activas por una serie de reacciones de oxidacin, catalizadas por dos tipos de enzimas. Las primeras reacciones ocurren en membranas extraplastdicas y resultan en una contraccin del anillo B de C6 a C5, tomando as la molcula la forma giberelica caracterstica. Estas reacciones son catalizadas por las Citocromo P-450 dependientes monooxigenasas y culminan con la formacin de GA12, la que se considera la primera GA, como tal, de la va. Posteriormente y en una tercera fase de sntesis, este intermediario o bien GA53 (producto de la 13-hidroxilacin de GA12) es metabolizado por enzimas solubles, llamadas dioxigenasas 2-oxoglutarato dependientes, las que utilizan el 2-oxoglutarato como co-sustrato. Dos tipos de dioxigenasas son

requeridas para convertir GA12 GA53 por vas paralelas en GAs activas. Las C 20-oxidasas y las 3-hidroxilasas. Un tercer grupo de dioxigenasas 2-
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oxoglutarato dependientes, las 2-hidroxilasas, producen la hidroxilacin de la posicin 2 de la molcula, produciendo con ello la prdida de actividad biolgica (Mac Millan 1997).
Biosntesis y metabolismo de GAs por Azospirillum sp. en medio de cultivo

Bottini et al. (1989) determinaron la capacidad de Azospirillum lipoferum Op33 de producir compuestos tipo GA1, GA3 e iso-GA3 en medio de cultivo qumicamente definido. La identificacin de estas formas endgenas de GAs se realiz por Cromatografa Gaseosa acoplada a Espectrometra de Masa con Monitoreo Selectivo de Iones (GC-MS-SIM), mientras que la cuantificacin se realiz por medio de test biolgicos en arroz (Murakami et al. 1972) y determin una concentracin equivalente a GA3 de 20 y 40 pg.ml-1 de GA1 y GA3 respectivamente. La identificacin y cuantificacin de GA1, GA3 e iso-GA3 se realiz por GC-MS, a partir de cultivos puros y determin que el patrn de produccin era de GA3>iso-GA3>GA1. Piccoli and Bottini (1996) pusieron de manifiesto la capacidad de Azospirillum lipoferum para producir los precursores inmediatos GA9 y GA19 lo cual permiti especular sobre la existencia de por lo menos dos vas de sntesis en la bacteria. La primera mediada por reacciones de 13-hidroxilacin temprana y que involucrara el metabolismo de GA19 a un precursor inmediato GA20 y la segunda mediada por reacciones de 3 y 13hidroxilacin tarda y que involucrara la conversin de GA9 a formas activas sobre el crecimiento vegetal. Piccoli et al (1996) y Piccoli et al. (1998) confirmaron la capacidad de Azospirillum lipoferum Op 33 de producir GA9, GA20 y GA5 en medio de cultivo qumicamente definido, lo cual aporta nuevos elementos para el complejo esquema de sntesis bacteriana. En otros ensayos, Piccoli and Botiini (1994) demostraron la capacidad de A. lipoferum Op33 de metabolizar GA20 a GA1, una molcula biolgicamente activa sobre el crecimiento vegetal en medio de cultivo qumicamente definido. En este trabajo,

no se caracteriz otro metabolito y esto permiti especular sobre la capacidad bacteriana de 3-hidroxilar este precursor inmediato solo a esta forma activa por medio de una va de 13-hidroxilacin temprana que finalizara con la produccin de GA1. Adicionalmente, Piccoli et al (1996) confirmaron la capacidad de la misma cepa bacteriana para metabolizar GA9 a GA3 (otra molcula con actividad biolgica). Estos resultados permitiran suponer que la promocin del crecimiento de plantas inoculadas, se debera al menos en parte, a la capacidad bacteriana de metabolizar precursores inmediatos de GAs, a formas biolgicamente activas para el crecimiento de la planta. En otros ensayos, Piccoli et al. (1998), Evaluaron exitosamente la capacidad bacteriana de hidrolizar glucosl conjugados de GAs, en medio de cultivo qumicamente definido, modificado por la adicin de un glucosl ester de GA20 de 13-O-glucsido de GA20, lo que confirm la capacidad del microorganismo de aumentar en la planta el pool endgeno de formas activas de giberelinas por la hidrlisis de glucosa a partir de conjugados sin actividad biolgica.
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Citocininas
Son un grupo de compuestos naturales que regulan la divisin y diferenciacin celular en tejidos no meristemticos de plantas superiores. Qumicamente son purinas, en su mayora derivadas de la adenina, que incluyen sus respectivos ribtidos, ribsidos y glucsidos. Estas fitohormonas se han asociado a un gran nmero de procesos fisiolgicos y celulares entre los que se detallan el retardo de la senescencia por acumulacin de la clorofila, la formacin de rganos en una gran variedad de cultivos de tejidos, el desarrollo de la raz, la formacin de pelos radicales, la elongacin de la raz, la iniciacin del tallo, la expansin de las hojas. Por definicin, son compuestos que en presencia de concentraciones ptimas de auxinas, inducen la divisin celular en cultivos o tejidos vegetales. El primer regulador con actividad especfica del tipo citocinina, fue descubierto por Miller et al. (1955) y se denomin cinetina (K) la cual fue considerada como una forma no natural de la hormona. En 1963, Letham, identific una forma natural que denomin zeatina (Z) y desde entonces ms de 40 molculas y sus metabolitos han sido clasificados. La bioactividad no es

uniforme en las formas identificadas y en la mayora de los casos depende del tipo de anillo aminopurina presente en la molcula; de la sustitucin del N6 con una cadena simple derivada de una unidad isopurina; de la sustitucin de las posiciones 2 y 9 del anillo, por grupos H, CH3-S ribosil y de la presencia de una cadena insaturada lateral con un ptimo de 5 carbonos. Las formas con mayor actividad biolgica descripta sobre tejidos o cultivos vegetales son la Zeatina (Z), isopentenil-adenina (iP), cinetina (K) y benziladenina (BAP) y todas poseen un doble puente alkilico en la posicin N6.
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Produccin microbiana de citocininas

Muchos microorganismos de la rissfera, entre los que se detallan bacterias y hongos, son capaces de sintetizar citocininas en cultivos qumicamente definidos. Barea et al. (1976) encontraron que al menos el 90 % de las bacterias aisladas de la rizsfera de cultivos de inters agronmico, fueron capaces de producir compuestos tipo-citocinas. Como resultado de la ntima relacin entre estos organismos y la superficie de la raz, la produccin exgena de esta hormona, puede tener un profundo efecto sobre el crecimiento de la planta. Al igual que lo reportado para las auxinas, la produccin microbiana de esta hormona, podra el suplementar el contenido endgeno de la planta y en ciertos casos promover el crecimiento vegetal o resultar fitotxica. En la actualidad sabemos que las plantas, responden a la adicin exgena de citocininas, lo cual representa un punto de gran inters, debido a que no se conoce la significancia ecolgica de la sntesis microbiana en los tejidos vegetales. A pesar de que la produccin microbiana de citocininas en plantas superiores comenz con modelos de microorganismos fitopatgenos, en la actualidad los investigadores se han volcado a la comprensin de este proceso en grupos de bacterias promotoras del crecimiento. El modelo mas estudiado en este sentido ha sido el de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, donde se ha investigado tanto la produccin de la hormona en el microsimbionte como en la planta. Desde el punto de vista fisiolgico, existe poca informacin que pueda relacionar en forma directa el efecto de la inoculacin con Azospirillum sp., la promocin del crecimiento vegetal y la produccin de citocininas. En este sentido Tien et al.

(1979) mostraron que la inoculacin con A. brasilense provocaba cambios significativos a nivel de la morfologa de raz de plntulas de pearl millet, observando incremento en el nmero de races laterales y en la densidad de los pelos radicales de cada raz. La aplicacin exgena de auxinas, citocininas y giberelinas produjo cambios en la morfologa de la raz comparables a los obtenidos por la inoculacin con la inoculacin. En otros ensayos, Cacciari et al. (1989) determinaron que el cultivo mixto de A. brasilense y Arthrobacter giacomelloi mostraba una gran produccin de giberelinas y citocininas, comparado con sus respectivos monocultivos, lo cual tendra gran importancia fisiolgica, debido a que la presencia de distintas especies microbianas en la rizsfera, inducira la produccin de citocininas y otras fitohormonas en bacterias PGPR.
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Etileno
Junto con auxinas, giberelinas y citosininas, el etileno es una hormona muy importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Burg 1962). Debido a su composicin gaseosa en condiciones fisiolgicas, por mucho tiempo, no se quiso aceptar como una fitohormona; sin embargo diferentes trabajos, demostraron que su sntesis y accin sobre la planta, era crtica para determinados procesos fisiolgicos. El etileno es una molcula muy simple y simtrica, compuesta por 2 tomos de C (Unidos en doble ligadura) y 4 tomos de H, soluble en agua en aproximadamente 140 ppm, 25 C y 760 mm Hg (15 veces mas que el oxgeno). Es muy activo y puede ejercer sus efectos fisiolgicos a concentraciones muy bajas en el tejido vegetal (0.1 ppm). En plantas superiores, todos los tejidos tienen capacidad de sintetizar esta hormona, pero en general la magnitud de la expresin, se asocia al estado de crecimiento y desarrollo de los mismos, siendo mas activa en aquellos tejidos en activa divisin celular, que se encuentran bajo condiciones de estrs en estado de senescencia (Burg and Burg 1968). Desde que Gane (1934) report por primera vez la capacidad de las plantas de sintetizar etileno, una gran variedad de compuestos, que incluyen metionina, cido linolnico, propanol, -alanina, etionina, etanol, glicerol, cidos orgnicos y

hasta glucosa y sacarosa (Yang 1974), han sido propuestos como posibles precursores de la hormona; sin embargo, en un trabajo in vitro de modelaje noenzimtico, Abeles and Rubistein (1964), revelaron que la metionina era el precursor natural por exelencia. En el caso de la sntesis microbiana, los precursores propuestos fueron muy variados (Fukuda and Ogawa 1991) pero la L-metionina ha sido el sustrato mayormente descripto en los cultivos bacterianos. La regulacin de la produccin de etileno en plantas superiores depende mayoritariamente de las enzimas consideradas clave de la biosntesis de esta hormona: S-adenosil-L-metionina (SAM) sintetasa, 1-aminociclopropano-1cido carboxlico (ACC) intetasa y ACC oxidasa. Tanto los genes que codifican para estas enzimas como sus elementos reguladores han sido caracterizados, modificados y re-introducidos en plantas de inters agrcola con fines agronmicos (Fluhr and Mattoo 1996). La SAM sintetasa cataliza la primera reaccin de la biosntesis a partir de metionina, aumentando el contenido de Sadenosil-L-metionina (SAM) para diversas rutas metablicas, dentro de las que se detallan la biosntesis de Etileno (Fluhr and Mattoo 1996) y poliaminas (EvenChen et al. 1982). La segunda reaccin es catalizada por la ACC sintasa y determina la hidrlisis de la SAM para formar ACC y 5-metiltioadenosina (MTA) (Kende, 1989). Finalmente la ACC oxidasa comanda la conversin de ACC a Etileno, CO2 y cianuro (John, 1991). Dentro de los factores que Inducen la produccin de Etileno, el estado de un rgano influye en la tasa de sntesis de esta hormona, siendo mayor en etapas donde las clulas estn en divisin, maduracin senescencia (Burg y Burg 1968).
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Produccin de etileno por Azospirillum

Existe muy poca informacin disponible, relacionada a la produccin de etileno por Azospirillum y su efecto sobre el crecimiento vegetal. Trabajos de Primrose and Dilworth (1976) determinaron la capacidad de bacterias promotoras del crecimiento vegetal de vida libre, Azotobacter y Bacillus de producir etileno en medio de cultivo qumicamente definido y esto fue un catalizador para que

Strzelczyk et al. (1994) testearan la capacidad de Azospirillum de producir este compuesto in vitro sobre diferentes fuentes carbonadas. Sus resultados determinaron que la bacteria poda sintetizar etileno y que la produccin dependa de la presencia de metionina en el medio de cultivo. Recientemente, Krumpholz et al. (2006) evaluaron la respuesta de crecimiento de plntulas de tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326 (sper productora de IAA), correlacionando el aumento significativo en el nmero y longitud de races, con la produccin vegetal de etileno de hasta 10 veces superiores a los controles. Los cambios morfolgicos fueron acompaados de un aumento de actividad de la ACC-sintasa, una de las enzimas clave de la ruta de sntesis de esta hormona. Segn Peck and Kende (1995), el paso limitante para la biosntesis de etileno es la conversin de la S-adenosilmetionina (SAM) a 1-
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aminociclopropano-1-cido carboxlico (ACC), catalizada por la ACC sintasa. La expresin y la actividad de esta enzima, as como la produccin de etileno, incrementan por la adicin de AIA exgeno. Algunos investigadores proponen un modelo en el que la capacidad de algunas bacterias para promover el crecimiento vegetal sera indirecta y estara en relacin directa a la expresin bacteriana de la enzima 1-aminociclopropano1-carboxilato deaminasa (ACC deaminasa). Esta enzima clave en metabolismo del etileno, hidroliza el 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) que es intermediario de la hormona activa (Glick, 1995). Bacterias que poseen esta enzima pueden clivar el ACC a amonio y alfa-cetobutirato y prevenir la acumulacin de etileno y sus efectos txicos (Glick et al. 1998). A pesar de que Azospirillum estimula el crecimiento de plantas, los miembros de este gnero no producen ACC deaminasa, por lo que no pueden regular los niveles de etileno en tejido vegetales. En este sentido Holgun and Glick (2001) comprobaron que la transferencia del gen de la ACC deaminasa de Enterobacter cloacae en Azospirillum brasilense result en una mejora considerable del crecimiento de la planta inoculada.
Azospirillum spp.
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Acido Abscsico
Es una hormona vegetal, involucrada diferentes procesos fisiolgicos del crecimiento y desarrollo de la planta, como la dormicin de yemas y semillas, la maduracin de frutos y en situaciones de estrs ambiental desfavorables como dficit hdricos o estrs salinos. El cido abscsico (ABA) se forma en plastidios, tanto de hoja como de raz y su biosntesis comienza a partir del cido mevalnico, va farnesil farnesil pirofosfato (FFPP), dentro de lo que se conoce globalmente como sntesis de los terpenos. La alternativa ms aceptada de
continuacin de la ruta metablica es la sntesis de carotenoides y su posterior clivaje para dar xantoxina y ABA. Este secuenciamiento opera en plantas superiores, especialmente bajo condiciones de estrs hdrico y salino. El ABA est relacionado con la capacidad de plantas superiores para adaptarse a condiciones de estrs, a travs de distintos procesos fisiolgicos y moleculares que incluyen: alteraciones en la expresin de genes relacionados con estrs hdrico y cierre de estomas. Desde el punto de vista fisiolgico, el ABA favorece la economa del agua dentro de la planta, por su efecto regulador sobre la apertura y cierre de estomas a nivel de las hojas (Davies, 1995); adems participa en la dormicin de yemas y semillas; en la acumulacin de protenas de reserva en semillas (soja); en la inhibicin del crecimiento y germinacin inducido por auxinas y GAs; en la inhibicin del crecimiento foliar en situaciones de estrs y en la regulacin de la sntesis proteica en respuestas de aclimatacin a diferentes tipo de estrs; sin embargo, todas estas funciones estn relacionadas a un objetivo comn, la defensa del sistema vegetal en condiciones ambientales desfavorables. Su valor fisiolgico ms importante ha sido relacionado con la sobrevivencia de la planta y el control de la economa del agua, ms que con incrementos de la produccin agrcola en s (Davies and Jones, 1991). La respuesta central de la planta a un dficit hdrico, tiene como resultado un incremento en la sntesis de ABA endgeno, que provoca los efectos fisiolgicos y bioqumicos antes mencionados, que son indefectiblemente acompaados de cambios en la
Azospirillum spp.

expresin de genes, muchos de los cuales son regulados por esta hormona (Bray, 1993). Bajo estas condiciones, las plantas requieren menos agua para su funcionamiento y as sufren menor dao. Un aspecto de sumo inters en la fisiologa de esta hormona es que la apertura y cierre estomtico en plantas superiores, puede ser regulada a distancia por medio de seales qumicas provenientes de la raz y el tallo, constituyendo la evidencia en tiempo real de la disponibilidad hdrica del suelo
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Produccin de cido Abscsico por Azospirillum

Es muy escasa la informacin documentada sobre la identificacin de ABA en cultivos qumicamente definidos de Azospirillum y su correlacin al crecimiento de la planta. La mayor parte de los ensayos fueron realizados en sistemas de cultivos e inoculaciones de hongos y bacterias fitopatognicas en asociaciones simbiticas por bacterias nodulantes. Solo un trabajo report la produccin de ABA por A. brasilense Ft326 en medio de cultivo definido (Kolb and Martin, 1985), sin embargo la identificacin se realiz por RIA tcnica poco sensible, comparada con la de espectrometra de masas, que se utiliza en la actualidad.
Interaccin
de
fitohormonas
producidas
por
Azospirillum sp. y su efecto sobre el crecimiento del sistema vegetal

El estudio de las interacciones entre las diferentes hormonas en los sistemas vegetales ha emergido en la actualidad y en este caso, las fitohormonas producidas por microorganismos endofticos no quedan exceptuadas del anlisis. Fulchieri et al. (1993) encontraron que plntulas de maz (Zea mays L.) inoculadas con las 3 cepas de Azospirillum lipoferum mejoraron
significativamente el crecimiento de la raz y de la parte area. En estos ensayos GA3 fue identificada en la fraccin cida libre del extracto vegetal y estos resultados permitieron especular sobre la capacidad bacteriana de incrementar in
Azospirillum spp.

vivo el pool de giberelinas con actividad biolgica sobre el crecimiento vegetal en las raices de plantas inoculadas. Ross and ONeill (2001) sugieren que las auxinas podran promover, al menos en parte, la elongacin del tallo por incrementar los niveles de endgenos de giberelinas 3-hidroxiladas, lo cual podra tener relacin directa con los resultados obtenidos por Fulchieri et al. (1993) ya que ni el contenido endgeno de IAA ni la expresin de los genes que codifican para 3-hidroxilasas fueron cuantificados en las fracciones correspondientes. Otro factor a considerar sera que por lo menos dos de las cepas utilizadas para la inoculacin (A. lipoferum Op 33, A. lipoferum iaa 320) eran productoras de AIA lo que permitira especular, que al menos en parte, el aumento en el contenido endgeno de GA3 en la raz podra deberse al cross-talk del AIA sobre el pool de GAs de la raz y que parte de la respuesta del crecimiento observado en parte area y subterrnea se debera al efecto de las GAs producidas por las diferentes cepas de Azospirillum lipoferum por las GAs producidas por las plntulas inducidas por el AIA bacteriano, como describen Yaxley et al (2001); Como mencionamos anteriormente, Krumpholz et al. (2006) han evaluado la respuesta de crecimiento de plntulas de tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326 (sperproductora de IAA), correlacionando el fenotipo vegetal con la produccin vegetal de etileno. El aumento en la produccin de etileno fue significativamente superior a los controles y los cambios morfolgicos fueron acompaados de un aumento de actividad de la ACC-sintetasa tisular. De acuerdo con Peck and Kende (1995), el paso limitante para la biosntesis de etileno es la conversin de la Sadenosilmetionina (SAM) a 1-aminociclopropano-1-cido carboxlico (ACC), catalizada por la ACC sintetasa y la expresin como la actividad de esta enzima, as como la produccin de etileno, incrementa por la adicin de AIA exgeno. Estos antecedentes indicaran que el aumento de etileno, al menos en parte de debera a un cross-talk entre el AIA producido por la bacteria en la va de sintesis del etileno como sugieren Rahman et al. (2002).
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Azospirillum spp.
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I. Aplicacin:
Algunas compaas en diferentes pases han registrado inoculantes de Azospirillum para maz y otros cultivos. Burdman y col. refieren que en Sudfrica se lleva a cabo la produccin de inoculantes a base

de Azospirillum para 150,000 hectreas de maz y 12,000 de trigo. Algunas caractersticas de la produccin de inoculantes a base de Azospirillum han sido discutidas. Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en Mxico la aplicacin de sta bacteria en diferentes cultivos ha rebasado con mucho lo hecho en otros pases. En el ciclo agrcola primaveraverano (PV) del ao 1999 la Secretara de Agricultura, a travs de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundacin Mexicana para la Investigacin Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboracin con el Centro de Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno-UNAM, llev a cabo la inoculacin de alrededor de 450,000 hectreas de maz y 150,000 hectreas de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas
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de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos. La evaluacin del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectreas de los diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de Mxico con caractersticas edficas en regiones climticas diferentes mostr el xito de la inoculacin en el rango de 62 a 95% de los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. El incremento promedio en la produccin de los cultivos de maz, trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes. La mejor respuesta a la inoculacin se present en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles intermedios de fertilizacin en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las

variedades "criollas" de maz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos y condiciones climticas evaluadas, los resultados de la inoculacin con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los cultivos de grano. El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la "inconsistencia de la inoculacin" tienen poco valor ante los resultados de produccin obtenidos en decenas de experimentos, as como los obtenidos en miles de hectreas con diferentes cultivos, variedades y condiciones edficas y climticas. An en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigacin bsica, tanto sobre la bacteria como en su interaccin con la planta, para un mejor entendimiento de la asociacin Azospirillum-planta. No obstante, en mi opinin, la aplicacin de Azospirillum como
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bioestimulante que incrementa la produccin de los cultivos deberia extenderse a todos aqullos lugares donde la aplicacin de fertilizantes es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos pases que tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se practica una agricultura reducir moderna, las la inoculacin cantidades de
con Azospirillum permitira
elevadas
fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de produccin como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminacin, sin detrimento de la produccin.
Azospirillum spp.

III.
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Conclusiones: El genero Azospirillum: es una proteobactria, Gram negativa que utiliza

como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminocidos y nitrgeno molecular.
Azospirillum es capas de sintetizar fitohormonas: como auxinas,

citosinas, ABA. Las cuales ayudan al crecimiento y mejoramiento de la calidad de la planta.
Esta bacteria puede crecer en la rizosfera o en el interior de las races. En la rizosfera acta como in regulador de fitopatogenos pues, inhibe el
crecimiento de hongos fitopatogenos y bacterias.
Mejora el crecimiento de las plantas, pues un cultivo inoculado con

Azospirillum spp tiene mejores resultados que otro fertilizado qumicamente.
El genero Azospirillum esta conformado por: A. lipoferum, A.
brasilienses, A. amazonense, A. halopraederans. Estos son utilizados como importantes biofertilizantes de suelos desgastados y con baja concentracin de nitrgeno. IV.
Bibliografa:
Br. Baiocchi Torres Alberto Alejandro. Br. Saavedra Barreto ngel Pedro. Caracterizacin de cepas nativas de Azospirillum spp. Y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en invernadero. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. FAcultadad de ciencias Biolgicas. Esp. Microbiologa y parasitologa. 17 de mayo del 2011.
Katty Baca1, Melgy Snchez1, Carmen Carreo1,*, Gilmar Mendoza2. Polihidroxialcanoatos de cepas de Azospirillum spp. Aisladas de races de Lycopersicon esculentum Mill. tomate y Oryza sativa L. arroz en Lambayeque. Scientia Agropecuaria 1(2010) 213 224. Disponible en: www.dialnet.unirioja.es/servlet/fichero_articulo?codigo=3708184
Mara de Lourdes Adriano Anaya1, Ramn Jarqun Glvez2, Carlos Hernndez Ramos1, Miguel Salvador Figueroa1 y Clara Teresa Monreal
Azospirillum spp.

Vargas2. Biofertilizacin de caf orgnico en etapa de vivero en Chiapas, Mxico*. Rev. Mex. Cienc. Agrc vol.2 no.3 Texcoco may./jun. 2011. Disponible
en:
35
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S200709342011000300009
Caballero-Mellado1*, J. Onofre-Lemus1, A. Wong-Villarreal1, R. CastroGonzlez1, P. Estrada-de los Santos1, J. Rodrguez-Salazar2, R. Surez2, G. Iturriaga2 y L. Martnez Aguilar1. 1Centro de Ciencias Genmicas-UNAM. Apdo. Postal No. 565-A, Cuernavaca, Morelos, Mxico. 2Centro de Investigacin en Biotecnologa-UAEM, Av. Universidad 1001, Cuernavaca 62209, Morelos, Mxico; *E-mail: jesuscab@ccg.unam.mx. USO DE
Azospirillum En Mxico como biofertilizante y potencial de nuevas especies bacterianas como biofertilizantes, agentes de biorremediacin y biocontrol de fitopatgenos. XIII Congreso Nacional De Biotecnologa Y Bioingeniera. DISPONIBLE EN: http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/simpos ios/simposio_agricola_vegetal/JESUS_CABALLERO.pdf Jess Caballero-Mellado. El gnero Azospirillum. rograma de Ecologa Molecular y Microbiana, Centro de Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno, UNAM, Ap. P. 565-A, Cuernavaca, Mor., Mxico. DISPONIBLE EN: http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap10/ Daz, Irma - Iglesias, Mara C. Inoculacin con Azospirillum sp. en cultivo de tomate (Lycopersicum esculentum vr. Coloso), bajo invernculo. Ctedra de Microbiologa Agrcola - Facultad de Cs. Agrarias UNNE. DISPONIBLE EN http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/2002/05-Agrarias/A-047.pdf Punos, Leonardo M. - Iglesias, Mara C. - Sotelo, Cristina. Utilizacin de inoculantes conteniendo Azospirillum en el cultivo de sorgo granfero. Universidad nacional del nordeste comunicaciones cientficas tecnolgicas 2 0 0 6. DISPONIBLE EN http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt2006/05-
Agrarias/2006-A-037.pdf

Microbiología de los suelos y Azospirillum

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Esp. Microbiologa y Parasitologa.

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Fig. 3.-Formacin de "velo" a 5 mm de la superficie en medio semi-solido selectivo para Azospirillum"

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Medio Nfb semislido: las placas Petri se incuban

Medio agar rojo de Congo: las Placas de Petri se incuban a

8. Identificacion Molecular: Prueba de PCR: la identificacin genotpica rutinaria de

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FLUJO-GRAMA PARA LA IDENTIFICACIN DE CEPAS DE Azospirillum

Lavar con agua potable y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2% x 5min

Cortar las races en trozos de 5 cm, enjuagarlas 2 veces y volver a cortar en 2 cm

Incubar Por 5 dias a 30C

Incubar de 3 a 5 dias a 30C

Esp. Microbiologa y Parasitologa.

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Cultivo puro primario en vial con agar nutritivo

(NH4+) inhibe la actividad de la nitrogenasa

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G. Interaccin con la planta:

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de Azospirillum inoculadas en trigo creciendo en condiciones de campo.

Esp. Microbiologa y Parasitologa.

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Mecanismos de estimulacin del crecimiento de las plantas:

Biosntesis bacteriana de auxinas

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Biosntesis y metabolismo de GAs por Azospirillum sp. en medio de cultivo

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Produccin microbiana de citocininas

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Produccin de etileno por Azospirillum

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Esp. Microbiologa y Parasitologa.

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Produccin de cido Abscsico por Azospirillum

Azospirillum sp. y su efecto sobre el crecimiento del sistema vegetal

Esp. Microbiologa y Parasitologa.

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