Antioksidan Kapasite Tayinlerinin Kimyas

Yrd. Do. Dr. Kubilay GL

DPPH SERBEST KK BALAMA YNTEM

Hazrlayan: Sercan TRKOLU

ANTOKSDAN
Canllarda, kimyasal sreler, zellikle oksitlenme, serbest radikallerin olumasna neden olur. Yksek derecede reaktif olan serbest radikaller farkl molekller ile kolayca reaksiyona girebilir ve bylece hcrelere, canlya zarar verebilir. Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek hcrelere zarar vermelerini nler. Bu zellikleriyle hcrelerin anormalleme ve sonu olarak tmr oluturma risklerini azalttklar gibi, hcre ykmn da azalttklar iin, daha salkl bir hayat yaama ansn ykseltir. nflamasyonlar, aldmz besin maddeleri, normal metabolizma, radyasyon, yalanma, normalden yksek oksijen basnc (pO2), ozon (O3), azot dioksit (NO2), kimyasal maddeler, sigara ve ilalar gibi birok uyarlarn etkisiyle, oksidan ad verilen molekller ortaya kar.

 Oksidanlar hcrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tm nemli bileiklerine zarar vererek kanser, kalp hastalklar, barsak hastalklar, depresyon, damarlarda yap bozukluklar ve erken yalanma gibi onlarca nemli soruna yol aarlar.
Birok hastaln temelinde veya ktlemesinde, ortaya kmasnda asl neden bu oksidanlardaki artn, vcuttaki antioksidan kapasitenin gcn amasdr.

Antioksidan Trleri
Antioksidan zellii kefedilen birok farkl madde vardr. Bu maddelerin bir ksmn diyetimizde (zellikle bitkilerden) alrken, bir ksmn vcut kendisi, serbest radikallere kar bir savunma sistemi olarak retir.
Vcudumuzun kendi rettii antioksidanlar endojen, dardan aldmz antioksidanlar ise eksojen antioksidanlar olarak adlandrlr.

Endojen Antioksidanlar;
Speroksit dismutaz (SOD) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon S-Transferazlar (GST) Katalaz (CAT) Melatonin Miyoglobin Hemoglobin Glutatyon Sistein Albmin

Eksojen Antioksidanlar;
-tokoferol (vitamin E) -karoten Askorbik asit (vitamin C) Folik asit (folat) Butilat hidroksitoluen (BHT) Butilat hidroksianisol (BHA) Sitokinler Sodyum benzoat

 Antioksidan zellikleri kapasite, etkinlik, g, aktivite gibi birok terimle tanmlanr.

Antioksidan aktivitesi reaksiyon koullarna baldr. Her yntem kendine zg koullara sahip olduundan ve her kouldaki kimyasal reaktivite deeri farkl olacandan, uygulanan yntemdeki sonular toplam antioksidan aktivite deerini vermeyebilir. Bu yzden farkl yntemlerle elde edilen sonularn kapasite terimiyle deerlendirilmesi daha dorudur.

DPPH SERBEST KK BALAMA YNTEM

Bu yntem ilk kez Stanford niversitesinde alan Marsden Blois tarafndan 1958 ylnda, 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH) radikallerinin antioksidan molekllerinin tayininde kullanlabileceinin nerilmesi ile ortaya kmtr. Antioksidan kapasite lmlerinin younlat yllarda BrandWilliams ve arkadalar yntemi gelitirmi ve bu yntem pek ok aratrmac tarafndan referans olarak kullanlmtr.

 DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) ticari olarak elde edilebilen stabil organik nitrojen radikalidir. 515 nmde maksimum absorbansa sahiptir. Moleklde bir serbest elektronun yer deitirmesi meneke renginin olumasna neden olur. DPPH solsyonu hidrojen atomu verebilen madde (antioksidan) ile kartrld zaman koyu meneke rengin kayb ile indirgenmi form oluur.
DPPH(1,1-difenil-2-pikril hidrazil) serbest kk balama metodu, lipid oksidasyonunu nleyen antioksidanlar iin genel olarak kabul edilmi bir mekanizmadr. Dier metodlarla karlatrldnda; DPPH serbest kk balama metodu, antioksidan kapasitelerin belirli koullara bal olarak ksa zamanda belirlenmesini salamaktadr. Antioksidanlarn DPPH serbest kkn balama kapasitelerinin, bunlarn hidrojen (H) iyonu verme yeteneklerinden kaynakland dnlmektedir.

 DPPH serbest kk balama metodunda, rneklerin H iyonu verme kapasiteleri, stabil bir serbest kk DPPH kullanlarak aratrlmaktadr. H iyonu verme yatknl olan bir bileiin varlnda DPPH kk indirgenir ve stabil indirgenmi formu oluur.

 Yntemin esas, DPPH ieren zelti ile hidrojen atomu verme eilimi olan bir molekln (antioksidan) zeltisinin kartrlmas sonucu DPPH radikalinin indirgenmesine ve zeltinin balangta mor olan renginin kaybolmasna dayanr. Mor renkli zeltinin UV-Grnr blge spektrometresinde 515 nm civarndaki absorbansnn azalmas llerek reaksiyon takip edilir.

Balang DPPH konsantrasyonunu % 50 azaltmak iin gereken rnek konsantrasyonu (EC50), antioksidan kapasiteyi hesaplamakta sklkla kullanlan bir yntemdir. Dk EC50 deeri yksek antioksidan kapasiteyi gsterir.
Dier bir parametre ise antiradikal etkinlik (AE=1/EC50) veya antiradikal gtr (ARP). Antiradikal etkinliin yksek olmas antioksidan kapasitenin yksek olmas anlamna gelmektedir.

 DPPH molekl stabil bir serbest radikal olarak, serbest elektronlar delokalize etmesiyle nitelendirilir. Bir rnek, DPPH zeltisi ile kartrldnda indirgenir ve bu indirgenmi form mor renk kaybna neden olur. DPPH radikalini Z le ve rnek molekl AH ile gsterecek olursak ilk aamada

Z + AH = ZH + A [1]
tepkimesi gerekleir. Bu tepkimede indirgenmi ZH molekl ve A radikali oluur. Bu ikinci radikal genel stokiyometri kontrolnde ilave reaksiyonlar geirir.

 Kalan DPPH radikali aadaki formlden hesaplanr. % DPPHKalan=([DPPH.]t / [DPPH.]t0) x 100

DPPH yntemi teknik olarak basit olmasna karn baz dezavantajlar bulunmaktadr. Birok antioksidan bileik lipid peroksidasyonunda rol oynayan peroksil radikalleri ile ok hzl tepkime verirken DPPH ile yava tepkime vermektedir. rnein Askorbik asit ile 1,15 dakika ve rutin ile 103 dakikada tepkime vermektedir. Sonu olarak antioksidan kapasitenin doru bir ekilde ifade edilemedii dnlebilir. Ayrca, DPPH ile antioksidan bileik arasndaki reaksiyon kinetiinin DPPH deriimi ile her zaman dorusallk gstermedii de bilinmektedir.

EC50-Etkin Konsantrasyon Deeri

DPPH yntemi sonularnn yorumlanmas iin etkin konsantrasyon deeri(efficient consentration valueEC50) adnda bir parametre ortaya konulmutur.

Bu parametre DPPH deriimini %50 orannda azalmasna neden olan substrat konsantrasyonu olarak tanmlanr.

Zeytin ve ay rneklerinden Ekstrakte Edilen Fenolik Bileiklerin Antioksidan zelliklerinin Deerlendirilmesi

Bu deneyde, zeytin ve ay rneklerinden elde edilen fenolik ekstraktlarn DPPH serbest kkn balama kapasiteleri, sentetik bir antioksidan olan BHT (Butilat Hidroksitoluen) ile karlatrlmtr. Zeytin ve ay rneklerinden elde edilen ve metanol iinde zndrlen fenolik ekstraktlarn 0.1 mLsi yine metanolle hazrlanan 6x10-5 mol/L konsantrasyondaki DPPH zeltisinin 2.9 mLsine eklenmitir. Absorbanstaki d 515 nmde llm ve reaksiyon sabitlenene kadar lme devam edilmitir. Fenolik ekstraktlarn DPPH ile reaksiyona girme hzlarndaki farkllktan dolay; ay rneklerinden elde edilen fenolik ekstaktlar 0.18, 0.9, 1.8 ve 3.6 x 10-4 mol/L, zeytin rneklerinden elde edilen fenolik ekstraktlar ve BHT ise 1.8; 3.6; 5.4 ve 9 x 10-4 mol/L konsantrasyonlarnda test edilmitir.

 Zeytin ve ay rneklerinden elde edilen fenolik ekstraktlarn ve BHTnin DPPH kkn 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanndaki balama kapasiteleri izelge 4.1de gsterilmitir.
Antioksidan Kayna
Konsantrasyon (x10-4mol/L)

DPPH Kkn Balama Kapasiteleri 30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zaman 27.485 79.065 19.663 37.840 8.026 13.139 42.612 84.512 21.057 42.494 13.152 22.453 51.557 87.905 22.907 50.425 14.151 24.469

Sabitlenme Zaman 100 100 150 150 70 70

ay Ekstrakt

1.8 3.6

Zeytin Ekstrakt

1.8 3.6 1.8

BHT 3.6

izelge 4.1 Fenolik ekstraktlar ve BHTnin 1.8, 3.6x10-4 M konsantrasyonlarnda DPPH kkn 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanndaki balama kapasiteleri (%)

 1.8x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ekstrakt ieren rnekler 30. ve 60. dakikalarda DPPHin % 19.663 ve % 21.057sini tutabilirken; bu oran ayn konsantrasyondaki ay ekstrakt ieren rnek iin % 27,485 ve % 42.612 ve ayn konsantrasyonda BHT ieren rnek iin % 8.026 ve % 13.152 olmutur (izelge 4.1). Sabitlenme zamanlarna bakldnda, 3.6x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ve ay ekstrakt ieren rnekler srasyla % 50.425 ve % 87.905 orannda DPPH tutabilirken; bu orann ayn konsantrasyonundaki BHT ieren rnek iin % 24.469 olduu grlmektedir (izelge 4.1). Zeytin ve aydan elde edilen fenolik ekstraktlar ve BHTnin , kk balama kapasitelerine ilikin verilerin istatistiksel analizlerine gre 30. dakika, 60. dakika ve sabitlenme zamannda ay ekstrakt> zeytin ekstrakt > BHT olarak bulunmutur.

 Buna ilaveten; 5.4 ve 9.0x10-4 mol/L konsantrasyonlarndaki zeytin ekstraktlarnn ve BHT rneklerinin DPPH kkn balama kapasiteleri llmtr. 9.0x10-4 mol/L konsantrasyonunda zeytin ekstrakt ieren rnek sabitlenme zamannda, DPPHin % 87.461ini tutabilirken; bu oran BHT ieren rnek iin ancak % 43.569 olmutur (izelge 4.2).
Antioksidan Kayna Zeytin Ekstrakt
Konsantrasyon (x10-4 mol/L)

DPPH Kkn Balama Kapasiteleri

30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zaman

Sabitlenme Zaman (Dakika) 150 150 70 70

5.4 9.0 5.4

35.780 57.457 12.966 19.206

49.414 70.637 29.147 37.762

64.235 87.461 31.833 43.569

BHT

9.0

izelge 4.2 Zeytin ekstraktlar ve BHTnin 5.4, 9.0x10-4 M konsantrasyonlarnda DPPH kkn 30. ve 60. dakikalar ile sabitlenme zamanndaki balama kapasiteleri

 izelge 4.3teki antioksidan aktivite sonularnn istatistiksel analizlerine gre, 30. dakika iin EC50 deerleri BHT > zeytin > ay olarak bulunurken; 60. dakika iin BHT > zeytin > ay; sabitlenme zaman iin zeytin BHT > ay olarak bulunmutur. Daha dk EC50 deerleri daha yksek antioksidan etkinlik anlamna geldiinden rneklerin antioksidan etkinlikleri en fazla ayda, en az BHTde bulunmutur.
Antioksidan Kayna
Balangtaki DPPH Konsantrasyonunu %50 Azaltmak in Gereken Antioksidan Miktar (EC50) (x10-4 mol/L)
30. Dakika 60. Dakika Sabitlenme Zaman

Zeytin

0.1860.004 0.0700.002

0.3960.007 0.1420.001

0.9010.049 0.2250.001

ay BHT

0.9390.166

0.8600.126

0.8600.096

izelge 4.3

Fenolik Ekstraktlarn ve BHTnin EC50 Deerleri

 Fenolik esktraktlar ve BHTnin Antiradikal Etkinlik (ARP) verilerine ilikin istatistiksel analizlerine gre; 30. ve 60. dakikalar iin ARP deerleri ay > zeytin > BHT olarak bulunurken; sabitlenme zaman iin ay > zeytin BHT olarak bulunmutur. Daha yksek ARP deeri daha yksek antioksidan etkinlik anlamna gelmektedir. Sabitlenme zamannda en iyi antioksidan etkinlik ay ekstraktlarnda bulunmutur.
Antioksidan Kayna 30. Dakika Antiradikal Etkinlik (ARP=1/EC50) 60. Dakika Sabitlenme Zaman

Zeytin
ay BHT

5.3830.102
14.8621.346 0.9470.190

2.5290.050
7.0370.062 1.1740.172

1.1120.058
4.4520.028 1.1700.131

izelge 4.4 Fenolik Ekstraktlarn ve BHTnin Antiradikal Etkinlii (ARP=1/EC50)