You are on page 1of 10

YKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFS (HPLC)

Nedir?
Sv kromatografisi ynteminin zel bir uygulamas olan yksek performansl sv kromatografisi (HPLC) ynteminde, sabit faz olarak kullanlan parack boyutlarnn nemli lde kltlmesi sonucu hareketli faz ile etkileen sabit faz yzey alan byr ve bylece kolonun etkinlii arttrlm olur. ok sk olarak doldurulmu kolondan hareketli fazn belirli bir hzla geebilmesi iin bir basn uygulanmas gerekir. Bu yksek verimdeki kolonlarn ve olduka yksek basnlarn kullanld HPLC, element trlendirilmesinde en yaygn biimde uygulanan kromatografi trdr.

Hangi alanlarda kullanlr?


HPLC gnmzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tp kimyas, bitki kimyas, tarm ve kimya mhendisliini ieren alanlarda ayrma ve analiz iin vazgeilmez bir ara olarak kabul edilmektedir.

Niin kullanlr?
Bilhassa dier kromatografik tekniklere uygun olmayan bileiklerin ayrlmas ve analizi iin uygundur. evre scaklnda termal olarak kararsz bileikleri ve yksek polarlktaki bileikleri herhangi bir trevlendirme olmakszn ayrabilir ve analiz edebilir.

HPLCnin sv kromatografisinin dier trlerinden stnlkleri nelerdir?


HPLC kolonu, rejenerasyon olmakszn pek ok kez kullanlabilir. Byle kolonlarda gerekletirilen ayrma, eski yntemlerle elde edilenden ok daha eitlidir. Bu teknik kullancnn becerisine daha az bamldr ve tekrarlanabilirlik daha yksektir. Nicel analiz amalar iin de kullanlabilir. Analiz sresi ok ksadr. Duyarlk ok yksektir, 10 mg lk bir rnek bile, floresans veya elektron yakalama dedektrleri kullanlarak tayin edilebilir.

Ayrmada rol alan unsurlar nelerdir?


Kolon Seimi Durgun faz, partikl bykl, vs.. Kolon Uzunluu Hareketli Faz Bileimi Kolon Scakl Ak Hz

HPLC cihaz ka blmden oluur?


zc datma blm Ayrma kolonu Dedektr ve kaydedici sistem

olmak zere blmden oluur

zc datma blm
HPLC cihaz, dier sv kromatografisi cihazlarndan, daha nce de belirtildii gibi, kolon giri ve k arasnda oluturulmas gereken yksek basn nedeni ile farkllk gsterir. Bu basn fark, kolon giriine bir pompa yoluyla uygulanan basn ile salanr. zc pompalama sistemi belki de HPLC sisteminin en nemli ksmdr. Pompann performans, analitik

sonulardaki tekrarlanabilirlii, nicel deeri, gzlenebilme snr vb. deerleri byk lde etkiler.

Ayrma kolonu
HPLC cihaznda kullanlan kolonlar, yksek basnc korumak iin paslanmaz elikten yaplmlardr. Bunlar batan baa dzgn bir i apa sahiptirler ve ticari olarak deiik byklklerde mevcutturlar. Bir kromatografik sistemin performans, kolonda gerekletirilen ayrma ile yani, kolon dolgu maddesinin seilmesi ve kullanlmasyla tayin edilir. Iyi bir kolon dolgu maddesi kararl olmaldr ve hem hareketli faz zclerine hem de rnek zeltilere kar inert olmaldr. Geni yzey alanna, dzgn olarak

dalm

ve

hareketli

faza

kolay

eriebilir

ak

yapsal

yzeye

sahip

olmaldr.Yksek basnve yksek ak hzlarndan etkilenmemelidir

Dedektr ve kaydedici sistem


rnek, hareketli faz ile birlikte kolon boyunca srklenerek dedektre tanr. HPLC cihazlarnda kullanlan dedektrler, dier sv kromatografisi cihazlarnda kullanlan dedektrlerle ayndr. Analizin amacna gre UV absorpsiyon, krlma indisi, floresans ve elektrokimyasal dedektrler kullanlr. Ideal bir dedektr u zelliklere sahip olmaldr: Dk grlt seviyesine sahip olmas nedeniyle ayrlan bileenlerin kk miktarlar gzlenebilir. Hzl ayrlan pikleri kaydetmek iin sratli cevap zamanna sahiptir. Hareketli fazdaki ak hz, scaklk ve fazn bileimindeki deiimlere kar bir dereceye kadar duyarszdr. Btn znenlere cevap verir veya en azndan tahmin edilebilir bir seicilie sahiptir. Kolay alr ve gvenilirlii fazladr. Oluan pikte kalitatif bilgi de salar.

HPLC de kullanlan dedektr eitleri:


UV Dedektr ya da DAD Dedektr Floresan Dedektr Elektrokimyasal Dedektr Krma ndisi Dedektr letkenlik Dedektr Ktle Spektrometresi

UV Dedektr ya da DAD Dedektr

UV

absorpsiyon

dedektr,

kolondan

ayrlarak

dedektre ulaan bileenlerin ultraviyole blgede yapt absorbansn lmne dayanr. Tek bir dalga boyunda alan dedektrler kullanlabildii gibi bir

monokromatr ile eitli dalgaboylarn seerek alan dedektrler de vardr. Tek dalgaboyunda alan dedektrlerde k kayna olarak genellikle 254 nmde ma yapan Hg lambas, eitli dalgaboylarn lebilen dedektrlerde ise dteryum lambas kullanlr. Spektrofotometrik lm temeli ile alan bir baka dedektr tr ise fotodiyot dizisidir. lmlerin ok hzl bir biimde yaplmasnn gerektii analizlerde genellikle bu dedektr kullanlr. UV

dedektrn karakteristikleri unlardr: * rneklerin UV- grnr blgede absorpsiyon yapmas gerekir. * Hareketli faz ak hz ve scaklk deiimlerinden etkilenmez. * Band geniletme etkisi kktr. * ok gvenilirdir, operasyonu kolaydr. * rnek zeltiyi bozmaz.

Floresan Dedektr

Floresans zellikleri tayan bileiklerin analizinde ise spektrofotometrik dedektrlere oranla duyarl daha fazla olan floresans dedektrlerin kullanlmas mmkndr. Bu dedektr ile 10-11 g/mL gibi ok dk gzlenebilme snrlarna inilebilmektedir. Luminesans zelliine sahip olan

ilalarn, aminoasitlerin tayini yaplabilir yada baz biyokimyasal bileikler floresant bir madde ile tepkimeye sokulup, yeni bir floresant rn veya etiketlendirilmi rn oluturulur. rnein; aminoasit ve proteinlerin bulunduu bir karm, 5-Dimetilaminonaftalinsulfonikasitklorr ile Dansil bileiklere evrilir ki bunlar keskin bir floresans gsterirler. Bu yolla bu bileiklerin 10-16 mola kadar tayini yaplabilir.

Elektrokimyasal Dedektr

10-11- 10-12 g/mL deerinde gzlenebilme snrna ulalan elektrokimyasal dedektrler, elektroliz sonucu akm llmesi ilkesine gre alr. Burada llen akm, rnek maddesinin elektrolizi sonucu olutuundan kullanlan zcnn elektrik akm vermemesi gerekir. Elektrokimyasal redoks tepkimelerine cevap veren ve polarografi ilkesine dayanan HPLC dedektr de yaygn olarak kullanlr.

Krma ndisi Dedektr

Iletkenlik dedektrleri kolondan kan iyonik haldeki bileenlerin lmnde kullanlr. Bu dedektr organik sistemler iin pek uygulanabilir deildir. Daha ok sulu sistemlere uygundur.

letkenlik Dedektr

Tm bileenleri lebilen, yani seimli olmayan krlma indisi dedektr ile yaplan lmlerde, krlma indisi scaklkla deitiinden, ok iyi bir scaklk kontrol yaplmaldr. ok ynll

mkemmeldir, fakat duyarll vasat olduundan eser analizler iin ideal deildir.

Dedeksiyon sisteminin korunmas


Dedeksiyon hcresinde gaz kabarcklar oluursa, tayinde problemler ortaya kar. Gaz kabarcnn oluumunu nlemek iin u nlemler alnmaldr: Sistemde sznt olmamaldr. Solvent HPLC sisteminde kullanlmadan nce degaze edilmelidir. Eter, pentan gibi uucu solventler sistemde buharlaacandan, bunlar kullanmaktan kanlmaldr.

Uygulamalar
HPLC sistemi ile hangi analiz yaplacak ise ncelikle o analiz icin gerekli artlar salanr. Analiz yaplacak numuneden, analiz yaplacak bileenin saf olarak ayrtrlabilmesi iin uygun ekstraksiyon yntemi bulunur. Daha sonra o analiz icin uygun kolon, haraketli faz ve ak hznn eilmelidir. Btn bu artlar yerine getirildikten sonra analiz edilecek maddenin bilinen bir deriimdeki standart sisteme enjeksiyon edilir. Standart ok saf olduu iin deney sonucunda sadece tek pik gzlenmelidir. Standartn kolondan k sresi (alkonma sresi) tespit edilir. Analiz edilecek zelti sisteme enjekte edildii zaman elde edilen kromatogramda deiik zamanlarda gelen birden fazla pik olmas muhtemeldir. Bu nedenle de standartn alkonma sresine denk gelen pik o kromatogramda bizim aradmz pik olacaktr. Daha sonra deriimi bilinen standartn verdii pikin altnda kalan alan veya pik ykseklii ( h) hesaplanr. rnek kromotogramndaki yeri tespit edilen bilinmeyen bileenin pikinin altnda kalan alan veya ykseklik hesaplanr. Sonuta orant hesaplamas ile analiz edilen bileenin deriimi hesaplanr.

Kaynaklar www.hacettepe.edu.tr www.muhendislikokulu.com

You might also like