PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini praktikan akan menganalisa kandungan kafein dalam suatu sampel minuman, dalam hal ini adalah kratindaeng. Teknik analisisnya adalah dengan menggunakan instrument HPLC. Teknik HPLC merupakan salah satu kromatografi cair-cair , yaitu metoda pemisahan dari suatu analit berdasarkan perbedaan interaksi fasa gerak dan fasa diamnya. Teknik HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan kualitatif. Analisa kuantitatif dapat dilihat dari pengukuran luas puncak/area dari analit pada kromatogram yang dibandingkan pada luas area standar dengan menggunakan kurva kalibrasi. Analisa kualitatif dapat dilihat dari waktu retensinya yang dibandingkan dengan daerah standar. Metoda HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan metoda untuk menentukan konsentrasi dan pemisahan suatu senyawa dengan mudah, cepat, dan teliti, dimana dalam sistem ini merupakan sistem kromatografi cair yang juga merupakan gabungan sistem antara High Speed Liquid Chromatography, High Eficiency Liquid Cromatography, High Pressure Liquid Cromatography. HPLC yang merupakan gabungan dari 3 sistem ini, memiliki beberapa keunggulan bila dibandingkan dengan kromatografi cair lainnya,diantaranya adalah kolom HPLC yang dapat dipakai berulang tanpa perlu diregenerasi,pemisahan yang memuaskan dapat tercapai pada kolom, peralatan HPLC dapat dioperasikan secara otomatis dan kuantitatif, serta waktu analisis yang relative singkat dan dapat dilakukan dalam skala besar. Deteksi senyawa pada instrumen ini menggunakan refraktometer inframerah. Prinsip kerja HPLC adalah melakukan pemisahan berdasarkan atas perbedaan koefisien partisi, yaitu perbedaan konsentrasi sampel dalam fasa diam dan perbedaan sampel dalam fasa gerak. Untuk HPLC yang digunakan dalam deteksi kafein ini fasa diamnya adalah C8, kolom C8 ini digunakan karena untuk analisa kafein akan lebih efektif apabila menggunakan kolom ini. Pemilihan kolom untuk analisa suatu zat itu sangat penting karena masing-masing kolom berbeda kepolarannya. Fasa diam dalam HPLC adalah polimer aktif yang dapat berupa padatan, larutan, resin penukar ion, atau polimer berpori. Fasa geraknya adalah cairan bergerak mengaliri fasa diam yang ditempatkan dalam kolom dengan aliran yang diatur oleh pompa. Dalam percobaan kali ini, fasa geraknya adalah campuran air 75% : methanol 25%. Hal itu disebabkan supaya fasa geraknya

berkurang kepolarannya agar dapat berinteraksi lebih lama sedikit dengan fasa diam dan analitnya (dalam hal ini supaya kecepatan elusi tidak terlalu cepat) karena disini analit kita adalah senyawa organic yang tentu saja itu non polar dan fasa diamnya juga non polar, agar ada interaksi terlebih dahulu saat pemisahan maka fasa geraknya kepolarannya jangan terlalu tinggi, harus dikurangi dengan menambahkan sedikit senyawa yang non polar juga (methanol). Fasa gerak pada HPLC harus berupa pelarut yang dapat melarutkan sampel secara sempurna, karena HPLC hanya bias menganalisa sampel yang terlarut sempurna dalam fasa geraknya.

Komponen komponen pada HPLC pada prinsipnya terdiri dari sistem gerak sebagai tempat pelarut, sistem pompa, sistem injeksi sebagai tempat injeksi sampel, kolom, detektor, rekorder. Sistem pompa pada HPLC ada 2, yaitu tekanan tetap dan volume tetap. Jika menggunakan sistem pompa tekanan tetap maka dilakukan dengan memberikan gas inert, sehingga fasa mobile dapat mengalir dengan tekanan konstan yang berakibat pada volume aliran fasa gerak yang melewati kolomnya tidak tetap. Hal ini mengakibatkan agak sulitnya memperoleh hasil yang akurat dan pengulangannya rendah. Namun, jika menggunakan sistem pompa dengan volume tetap akan terjadi perubahan permeabilitas pada sistem karena perubahan viskositas pada fasa gerak dapat dihilangkan oleh adanya volume aliran yang konstan. Perubahan dapat berakibat buruk pada waktu retensi, resolusi, dan memberikan base line yang tidak stabil. Pengendalian aliran dapat memberikan aliran fasa mobil akibat adanya perubahan tekanan gas. Dalam HPLC dikenal ada 2 pengendali aliran, yaitu Isokratik dan Gradien Elusi. Elusi isokratik hanya memerlukan 1 macam komposisi pelarut (pelarut tunggal). Jika pelarut terdiri

dari dua komponen, maka sebelumnya harus kita campurkan terlebih dahulu sesuai komposis yang ditentukan sehingga menjadi pelarut tunggal. Hal ini berbeda dengan gradient elusi, pada gradient elusi dapat menggunakan lebih dari pelarut yang secara otomatis dapat diubah komposisnya sesuai kebutuhan, sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik walaupun menggunakan dua pompa. Makdsudnya disini adalah, apabila pelarutnya menggunakan 2 komponen maka masing-masing komponen masih terpisah dan akan tercampur sendiri yang akan diatur oleh program. Pada percobaan kali ini, yang digunakan adalah teknik elusi isokratik karena fasa geraknya sudah dicampur terlebih dahulu. Pemilihan detektor berdasarkan perbedaan pengukuran dari sifat yang mendasar antara sampel dan fasa gerak, dan pengukuran ditujukan pada sifat yang sangat spesifik terhadap sampel dengan atau tanpa perubahan fasa mobil sebelum dideteksi. Adapun detektor HPLC mempunyai karakteristik tingginya sensitivitas yaitu lebih dari 0,1 gram sampel dalam 1 fasa

mobil, respon yang menyeluruh terhadap sampel, mempunyai respon yang linier pada setiap konsentrasinya, tidak merusak sampel, tidak sensitive terhadap perubahan temperature dan perubahan kecepatan fasa aliran gerak, serta dapat beroperasi secara terus menerus. Percobaan kali ini dilakukan untuk menganalisa kadar kafein yang terkandung dalam suatu sampel. Hal pertama yang harus diketahui adalah waktu retensi dari kafein standar agar dapat dibandingkan pada saat mengukur kadar kafein pada sampel yang berupa kratindaeng tersebut. Pengujian kadar kafein ini berguna untuk menguji apakah benar bahwa kadar kafein yang tertera pada label kemasan sesuai dengan kondisi dilapangannya. Kafein [1,3,7-trimetil-1Hpurin-2,6(3H,7H)-dion] merupakan alkaloid jenis purin/xantin (lihat Gambar 5.). Kafein banyak ditemui pada daun teh (Camellia sinensis) dan biji kopi (Coffea arabica). Kafein hanya ditemui pada beberapa tumbuhan dan bertindak sebagai pestisida alami. Kafein murni merupakan padatan putih tak berbau berbentuk jarum atau serbuk.

Gambar 5. Struktur kafein. Kafein merupakan suatu stimulan pada sistem saraf pusat dan metabolisme tubuh, dimana senyawa ini digunakan secara medis untuk mengurangi rasa nyeri dan untuk memperbaiki kewaspadaan mental. Pada tingkat yang lebih tinggi, kafein digunakan untuk menstimulasi sistem syaraf pusat, meningkatkan kewaspadaan dan menyingkirkan rasa kantuk, meningkatkan fokus dan konsentrasi, serta memperbaiki koordinasi tubuh secara keseluruhan. Kafein juga digunakan sebagai kombinasi untuk menghilangkan rasa sakit. Selain itu, kafein juga digunakan bersama ergotamin pada pengobatan migrain dan sakit kepala yang diakibatkan oleh antihistamin. Saat ini kafein tidak hanya ditemukan pada minuman teh atau kopi, tetapi juga ditemukan sebagai aditif pada berbagai jenis minuman ringan (misalnya kola) dan minuman berenergi. Untuk mengetahui waktu retensi kafein menggunakan HPLC , praktikan mengukurnya pada berbagai konsentrasi kafein, dalam hal ini akan dijadikan sebagai larutan standar yang akan dibuat kurva kalibrasinya dimana nanti akan dijadikan sebagai pembanding ketika melihat kadar kafein dalam sampel. Untuk larutan standar ini, dibuat kafein pada konsentrasi 20 ppm, 60ppm, 100ppm, dan 200ppm. Masing-masing dari larutan tersebut diukur bagaimana waktu retensinya dan dilihat luas areanya lalu dibuat grafik dengan memplotkan konsentrasi standar kafein sebagai sumbu x dan luas kromatogram sebagai sumbu y nya untuk mendapatkan persamaan linearnya.Ketika persamaan garis telah didapatkan, luas kromatogram pada berbagai sampel minuman yang mengandung kafein diukur kemudian ditentukan konsentrasi kafeinnya dengan persamaan garis linear yang didapat.

Larutan standar kafein pada berbagai konsentrasi dibuat dengan melarutkan padatan murni kafein dengan massa yang berbeda-beda di dalam aquabides. Kemudian luas kromatogram-nya diukur secara digital setelah menginjeksikan larutan standar ke dalam instrumen HPLC. Persamaan garis linear yang didapat adalah y = 23865 x + 59638, dengan y adalah luas kromatogram pada HPLC dan x adalah konsentrasi kafein di dalam larutan dalam ppm. Setelah persamaan garis linear didapat, kadar kafein dalam berbagai sampel minuman dideteksi menggunakan HPLC. Sampel minuman dibuat aliquot-nya yaitu mengambil 5 ml sampel lalu menambahkan aquabides pada sejumlah kecil sampel di dalam labu ukur 25 mL. Kemudian serupa dengan pengukuran pada larutan standar kafein, sampel diinjeksikan pada instrumen dan diukur luas kromatogram-nya pada peak tertinggi. Kemudian luas kromatogram (y) digunakan untuk menentukan konsentrasi kafein (x) dalam aliquot sampel. Karena merupakan aliquot, konsentrasi kafein sesungguhnya dalam sampel didapat melalui pengalian konsentrasi kafein dari persamaan garis linear dengan faktor pengenceran. Berdasarkan percobaan, diperoleh bahwa waktu retensi kafein itu disekitar 7.8 8.8. menit. Untuk sampel ini ternyata kafeinnya muncul diwaktu retensi 7,008 menit dengan luas kromatogram 1565533. Dengan persamaan linier dari kurva kalibrasi standar maka dapat diperoleh
kosentrasinya yaitu sebesar 63,1006 ppm atau sebesar 47,32 mg kafein didalam 150 ml sampel tersebut. Disini terlihat bahwa terjadi penurunan kadar kafein dari yang tertera pada label kemasan. Hal ini dikarenakan sampelnya yang sudah lama sehingga sudah terdekomposisi.

Selain menganalisis kadar kafein pada sampel, praktikan juga menganalisis kafein pada sampel pribadi. Dengan perlakuan yang sama, maka didapatkan juga daerah peak pada waktu retensi disekitar waktu retensi kafein standar. Dengan persamaan linear dari kurva standar tersebut dapat dilakukan perhitungan konsentrasi dari masing-masing sampel pribadi. Untuk sampel bachtiar konsentrasinya adalah 85.535 ppm, sampel rahmadia konsentrasinya adalah 30,403 ppm ,sampel isnanda konsentrasinya sebesar 82,718 ppm, dan sampel suanto konsentrasinya sebesar 29,954 ppm.

ANALISA KESALAHAN
Kesalahan yang mungkin terjadi pada pengukuran kadar kafein dalam sampel minuman berenergi kratindaeng ini dapat diakibatkan oleh tiga faktor, yaitu kesalahan metodik, instrumental, dan operator. Kesalahan metodik merupakan kesalahan yang disebabkan oleh metode yang kurang tepat atau kurang teruji dalam penentuan kadar kafein. Kesalahan instrumental terjadi akibat tidak dikalibrasinya alat yang digunakan maupun alat yang tidak bekerja dengan baik sebagaimana mestinya. Sementara itu kesalahan operator dapat berupa penimbangan dan pembuatan larutan standar kafein yang salah, pembuatan aliquot sampel, kesalahan dalam pengoperasian alat, hingga kesalahan dalam perhitungan sehingga hasil akhir yang didapatkan mengandung galat.

KESIMPULAN
Metode pengukuran kadar suatu zat dalam sampel menggunakan instrumen HPLC tidak berbeda dengan kromatografi cair pada umumnya dimana digunakan fasa stasioner/diam dan fasa mobil/gerak. Kafein merupakan suatu alkaloid purin/xantin yang memiliki kepolaran rendah serta larut dalam hidrokarbon sehingga digunakan HPLC fasa balik (reverse phase) dan fasa mobil metanol/air dengan perbandingan 25 : 75 Waktu retensi kafein pada larutan standar sekitar 7,8-8,8 menit. Persamaan garis linear yang menghubungkan konsentrasi larutan standar kafein dengan luas kromatogram HPLC yang dibentuk adalah y = 23865 x + 59638, dimana luas kromatogram pada HPLC dan x adalah konsentrasi kafein di dalam larutan dalam ppm. Kadar kafein di dalam sampel ditentukan melalui regresi linear luas kromatogram HPLC yang dibentuk oleh aliquot sampel pada peak tertinggi menggunakan persamaan linear yang didapat. Kadar kafein yang didapat untuk sampel minuman kratindaeng ini adalah sebesar 63,1006
ppm atau sebesar 47,32 mg kafein didalam 150 ml sampel tersebut.

Pengukuran kadar kafein sampel pribadi adalah , sampel bachtiar konsentrasinya sebesar

85.535 ppm, sampel rahmadia konsentrasinya sebesar 30,403 ppm ,sampel isnanda konsentrasinya sebesar 82,718 ppm, dan sampel suanto konsentrasinya sebesar 29,954 ppm. Kesalahan/galat yang terjadi dalam pengukuran kadar kafein dalam sampel minuman dapat diakibatkan oleh kesalahan metodik, instrumental, maupun operator.

DAFTAR PUSTAKA
Sunardi. 2012. Penuntun Praktikum Kimia Analisa Instrumentasi. Depok: Departemen Kimia FMIPA UI. Sarker, Satyajit D. 2011. Natural Products Chemistry pada A. Herry Cahyana (2011) Lecture Notes: Natural Products Chemistry. Depok: Departemen Kimia FMIPA UI. Day Jr, R.A & A.L. Underwood. 1998. Quantitative Analysis 6th ed. Prentice-Hall, Inc. Skoog, D.C., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry 8th ed. Thomson Learning, Inc.