USMENI ISPIT IZ MIKROBIOLOKE KONTROLE FRMACEUTSKIH I KOZMETIKIH PROIZVODA I PROCESA Pitanja: 1. Odreivanje broja mikroorganizama 2. Klostridije 3.

Clostridium perfringens 4. Bacillus Bacillus cereus 5. Listeria monocytogenes 6. Staphylococcus aureus 7. Enterococcus 8. E. coli 9. Salmonella 10. Shigella 11. Pseudomonas aeruginosa 12. Campylobacter 13. Candida albicans 14. Aspergillus fumigatus 15. Bakterije indikatori fekalnog zagaenja vode 16. Mikrobioloke analize vode za pie vode i prirodnih mineralnih voda 17. Industrijski znaaj biofilmova 18. Nastanak i razvoj biofilma 19. Mehanizmi delovanja biocida 20. Bakterijska rezistentnost na biocide 21. Faktori izbora delovanja antimikrobnog sredstva 22. HACCP pojam, razvoj, prednosti i mane 23. Faze implementacije HACCP-a (1-5) 24. Principi HACCP-a. Nain izazivanja zdravstvenih tegoba: Alimentarne infekcije nastaju posle unosa ivih mikroorganizama hranom, koji se u digestivnom traktu umnoavaju ili ga kolonizuju i na taj nain izazivaju invazivnu infekciju. Najeci uzronici alimentarnih obolenja kod nas i u svetu su Salmonella spp., Campylobacter spp., E. coli O157,

Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica.

Toksoinfekcije nastaju nakon unoenja ivih mikroorganizama putem hrane, koji se u digestivnom traktu razmnoavaju i stvaraju jedan ili vie toksina, kojima oteuju tkiva ili funkciju pojedinih organa. Mikroorganizmi koji formiraju toksine u hrani pre unoenja u organizam najee su Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum i Bacillus cereus. Alimentarne intoksikacije nastaju kao posledica unoenja specifinih toksina predhodno nastalih u namirnici. Za njihovo nastajanje nije potrebno unoenje ivih bakterijskih elija. Toksini koji se formiraju u crevima ljudi nakon unoenja hrane poreklom su uglavnom od Clostridium perfringens i Bacillus cereus (dijarejalni toksin). Bolesti izazvane hranom postale su jedan od najveih problema javnog zdravstva, razlog su: globalne promene i zagaenje ivotne sredine nove tehnologije proizvodnje i prerade hrane industrijalizacija i poveana masovna proizvodnja nov nain ivota svetski turizam i meunarodna trgovina povean broj osetljivih ljudi opadanje imuniteta stanovnitva pojava novih uzronika i mutiranje postojeih

ODREIVANJE BROJA MIKROORGANIZAMA Odreivanje brojnosti mikroorganizama moe se vriti na dva naina, direktnim i inderktnim metodama. Direktnim metodama se neposredno odredjuje ukupan broj mikroorganizama, ali je nedostatak metode nemogunost razlikovanja ivih i mrtvih elija. Indirektne metode (odgajivake, optike) podrazumevaju posredno posmatranje mikroorganizama metodama izolacije i gajenja u laboratoriji, pri tome se broje samo ive elije. U direktne metode spadaju: Metoda po Breed-u; brojanje mikroorganizama na obojenom razmazu suspenzije na odredjenoj povrini predmetnice Komore za brojanje; primenjuje se za brojanje mikroorganizama veih dimenzija (alge, kvasci, krupnije bakterije spore gljiva i plesni) u uzorku vode odredjene zapremine. Sitniji mikroorganizmi padaju na dno komore i tee se uoavaju pod mikroskopom Membranski filtri; metoda bakterioloke filtracije. Za kvantitativne analize koriste se nitrocelulozni filtri sa veliinom pora 0,2 m. Indirektne odgajivake metode: Bira se podloga i uslovi kultivacije (temperatura, vremenski period inkubacije) koji su selektivni za eljeni mikroorganizam a nepovoljni za ostale neeljene mikroorganizme. Ipak ni jedna podloga nije potpuno selektivna. Strategija obogaivanja kulture jeste da, to je vie mogue, oponaa optimalne uslove koji postoje u sredini u kojoj se eljeni mikroorganizam nalazi, i na taj nain omogui njegovu izolaciju. Primenjuju se klasine metode razreivanja i zasejavanja odgovarajueg razreenja na tene ili vrste podloge. Prema tome razlikujemo odreivanje broja mikroorganizama na vrstim i tenim hranljivim podlogama. Na vrstim podlogama odreuje se CFU (Colony Forming Unit), pri emu je validan broj kolonija na petri ploi 30 do 300. Pripremi se sterilisana agarizovana hranljiva podloga i razlije se u petri ploe. Na podlogu se sterilnom pipetom nanosi 0,1 ml inokuluma iz odgovarajueg razreenog uzorka (slika) i sterilnim stapiem razmae po povrini podloge. To se radi se u 3-5 ponavljanja. Petri ploe se odlau u obrnutom poloaju u termostat na inkubaciju, na temperaturi koja je propisana za svaki mikroorganizam. Nakon inkubacije vri se brojanje. Rauna se prosean broj kolonija po petri ploi, a brojnost se izraava u 1 ml uzorka (mnoenjem prosenog broja kolonija sa primenjenim razredjenjem). Na tenim podlogama odreuje se MNP (Most Probable Number) a itanje se vri po Mac Credy-vim tablicama iz serije razredjenja. Zasejavanje se vri iz serije razredjenja (iz svakog razredjenja u 3-5 ponavljanja) u tene hranljive podloge koje su razlivene i sterilisane u epruvetama. Nakon inkubacije vri se oitavanje broja pozitivnih epruveta iz svakog korienog razredjenja (epruvete u kojima se uoava rast). Najverovatniji broj mikroorganizama se oitava pomou tablica po Mac Credy-u. Indirektne optike metode: Zasnivaju se na optim principima merenja mutnoe optikim aparatima kao to su kolorimetar, nefelometar, turbidometar, spektrofotometar... Najee se primenjuju za odredjivanje broja mikroorganizama u istim kulturama. Ove metode se ne mogu primenjivati za odredjivanje brojnosti u supstratima koji se boje, koji pored mikroorganizama sadre i druge suspendovane materije, niti za odreivanje broja mikroorganizama koji imaju nehomogen rast. Pre nego to se pristupi odredjivanju brojnosti neophodno je napraviti kalibracionu krivu za svaki aparat, odnosno soj mikroorganizama ija se

brojnost odredjuje. Kalibraciona kriva pokazuje zavisnost izmeu gustine mikroorganizama i procenta apsorpcije svetlosti. Do kalibracione krive se dolazi na taj nain to se napravi serija razredjenja ispitivane kulture, izmeri % apsorpcije svetla (ili ekstinkcija kod nekih aparata) i odredjuje brojnost direktnom ili odgajivakom metodom. Rezultati merenja i brojnost se unesu u koordinatni sistem, a zatim konstruie kalibraciona kriva. Kriva omoguuje brzo odredjivanje brojnosti na osnovu izmerene apsorpcije svetlosti datog uzorka. KLOSTRIDIJE Sulfitoredukujue klostridije su sporogene, obligatno anaerobne, tapiaste, G(+) bakterije. Nalaze se u zemljitu, praini, organskom ubrivu, digestivnom traktu ljudi i ivotinja, klinikim uzorcima, vodi, biljkama, insektima... tj. ubikvitarne su prirode. Veina vrsta je pokretna. Fermentativno usvajaju ugljene hidrate, daju negativne biohemijske katalaza i oksidaza testove. Sporulacija omoguuje preivljavanje mikroorganizama u prirodnoj sredini i nepovoljnim uslovima. Dugovenost bakterijskih spora je zapanjujua, prema nekim podacima one preivljavaju i preko 50 godina. Zdravstveni znaaj klostridija: od ukupnog broja vrsta Clostridium (preko 100) manje od 20 je patogeno. Patogene Clostridium spp. II III enteropatogene i histotoksine enterotoksin klostridije produkujue klostridije

I neurotoksine klostridije

IV ostale klostridije

C. tetani C. botulinum
(tipovi A-G)

C. chauvoei C. septicum C. novyi (tip A) C.perfringens (tip

A)

C. perfringens (tipovi A-E)

C. sordellii C. haemolyticum C. novyi (tip B)

C.colinum C.difficile C.piliforme C.spiroforme

Neurotoksine klostridije deluju na neuromuskularnu funkciju organizma bez uoljivog oteenja tkiva, a histotoksine vrste izazivaju relativno lokalizovane lezije tkiva (miia i jetre). toksigeni sojeve C. perfringens izazivaju inflamatornu leziju gastrointestinalnog trakta sa enterotoksemijom, dok su klostridije etvrte grupe u vezi sa sporadinim individualnim oboljenjima. Sve patogene vrste klostridija se u organizam unose pasivno. Kod uzronika alimentarnih intoksikacija za izazivanje oboljenja odgovoran je toksin osloboen u namirnici. Sinteza veoma aktivnih toksina klostridija je u direktnoj vezi sa niskim oksidoredukcionim potencijalom sredine i sporulacijom vegetativnih elija. esto brojnost vegetativnih elija nije od odluujueg znaaja za toxigenost vrsta. Vrste koje se nalaze u intestinalnom traktu ljudi i ivotinja, kao to su C. perfringens i C. sporogenes, prodiru u krv i tkiva i zajedno sa fakultativno anaerobnim bakterijama (Proteus spp.) neposredno pre ili ubrzo nakon smrti domaina, izazivaju truljenje i dekompoziciju leeva.

C. botulinum je vrsta koja ukljuuje sedam toksinih tipova: A, B, C, D, E, F i G. Svi sojevi produkuju neurotoksine sa slinim efektima, ali se toksini pojedinih tipova seroloki razlikuju. Toksin C. botulinum je

najjai bakterijski toksin, proteinske je prirode i termolabilan (unitava ga relativno kratkotrajno zagrevanje za 30 minuta na 80 oC, odn. za 10 minuta na 100 oC). Toksin je otporan prema eludanom soku i jedini je bakterijski egzotoksin koji izaziva trovanje kada se unese oralnim ili parenteralnim putem. Botulinski toksin je prema svom afinitetu neurotropan, slian tetanusnom, a donekle i difterinom. Patoloko stanje: botulizam nastaje konzumiranjem namirnica u kojima se nalazi botulinski toksin. Sindrom botulinske intoksikacije sastoji se od neuroparalitikih poremeaja koji se manifestuju paralizom. Spore odn. vegetativne elije C. botulinum se nalaze se u zemljitu, slatkim i slanim vodama, u crevima oveka, sisara i riba. Same spore C. botulinum nisu patogene za oveka jer prolaze bez ikakvih posledica kroz probavni trakt. Ljudi se intoksiciraju preko suvog mesa, kobasica, a naroito preko nesterilnih konzervi povra i mesa u koje je C. botulinum izluio toksin.

C. tetani je specifian po tome to su elije mlade kulture G(+), ali nakon 24 sata inkubiranja postaju G(). C. tetani izluuje pravi egzotoksin (sastavom ist i homogen protein) koji se sastoji iz dva razliita
rastvorljiva antigena: hemolizina (tetanolizina) i neurotoksina (tetanospazmina). Iako se tetanusni toksin vezuje gotovo za sva tkiva, najvei afinitet ima prema sivoj masi nervnog tkiva, za nju se vezuje tetanospazmin.

Tetanolizin ima afinitet prema eritricitima koje hemolizuje. Toksin je neaktivan ako se unese oralnim putem jer ga razgrauje HCl eluca. Takoe je neaktivan i ako se unese konjuktivalnim ili rektalnim putem. Delovanje toksina se ispoljava delimino na nervno tkivo kimene modine - poveanjem refleksne nadraajnosti, a delimino na periferne nerve - izaziva miine spazme. Spore C. tetani se nalaze u zemljitu, intestinalnom traktu konja, svinja, krava i drugih ivotinja, ponekad i oveka. Rezervoar i najvei izvor spora je zemljite iz koga se, direktno putem ozleda na koi, unose u organizam.

C. perfringens ("perfringens" - probiti) je ranije imao naziv C. welchii. Spada meu najrasprostranjenije

anaerobne mikroorganizme u zemljitu, vodi, fekalnim masama... Njegov toksin je odgovoran za moinekroze (gasne gangrene) kod ljudi i ivotinja, kao i alimentarne toksikoinfekcije. Raspolae veoma aktivnim i raznovrsnim enzimima, produkuje znatne koliine lecitinaze od kojih je lecitinaza C. perfringens-a tipa A toksina. C. perfringens je bakterijska vrsta koja produkuje najvei broj toksina, 5 egzotoksina su odgovorni za oboljenja ljudi i ivotinja. Ovi egzotoksini su osnova toksikoloke podele vrste na tipove: A, B, C, D i E. Osim ovih letalnih toksina, sojevi C. perfringens produkuju i nekoliko enzima koji mogu da imaju ulogu u patologiji. Sojevi tipa A i neki sojevi tipa C i D produkuju i enterotoksin koji je odgovoran za alimentarne toksikoinfekcije ljudi. Vegetativne elije stvaraju enterotoksin samo tokom sporulacije, spore prisutne u namirnicama koje preive kuvanje (obino u mesu i mesnim proizvodima) klijaju dajui veliki broj vegetativnih elija. Tako unete u organizam elije sporuliu oslobaajui enterotoksin. Pored patogenih vrsta klostridija postoji veliki broj onih koje nemaju zdravstveni znaaj. Ove nepatogene (netoksigene) vrste svojom fiziolokom aktivnou tj. fermentacijom ugljenih hidrata i proteina, izazivaju promene senzornih i nutritivnih svojstava namirnica i njihovo kvarenje. Takve su: C. aceticum, C.

acetobutylicum, C. baratii, C. beijerinckii, C. bifermentans, C. butyricum, C. cadaveris, C. pasterianum, C. polysaccharolitycum, C. propionicum, C. putrefaciens, C. putrificum, C. saccharolyticum, C. sporogenes, C. thermosaccharolyticum, C. tyrobutyricum. Uzevi u obzir rezervoare klostridija, izvesno je da su glavni

izvori kontaminacije prehrambenih proizvoda ovim bakterijama, upravo sirovine koje sadri njihove spore. Dokazano je njihovo prisustvo u zemljitu, konzervama povra, zainima, medu, ajevima, mesu, ribljim konzervama, suenom ribljem mesu, siru (epidemija botulizma u Italiji 1996), biofilmovima.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS C. perfringens ("perfringens" - probiti) je ranije imao naziv C. welchii. Spada meu najrasprostranjenije
anaerobne mikroorganizme u zemljitu, vodi, fekalnim masama... Njegov toksin je odgovoran za moinekroze (gasne gangrene) kod ljudi i ivotinja, kao i alimentarne toksikoinfekcije. Raspolae veoma aktivnim i raznovrsnim enzimima, produkuje znatne koliine lecitinaze od kojih je lecitinaza C. perfringens-a tipa A toksina. C. perfringens je bakterijska vrsta koja produkuje najvei broj toksina, 5 egzotoksina su odgovorni za oboljenja ljudi i ivotinja. Ovi egzotoksini su osnova toksikoloke podele vrste na tipove: A, B, C, D i E. Osim ovih letalnih toksina, sojevi C. perfringens produkuju i nekoliko enzima koji mogu da imaju ulogu u patologiji. Sojevi tipa A i neki sojevi tipa C i D produkuju i enterotoksin koji je odgovoran za alimentarne toksikoinfekcije ljudi. Vegetativne elije stvaraju enterotoksin samo tokom sporulacije, spore prisutne u namirnicama koje preive kuvanje (obino u mesu i mesnim proizvodima) klijaju dajui veliki broj vegetativnih elija. Tako unete u organizam elije sporuliu oslobaajui enterotoksin. Postupak izolovanja i identifikacije klostridija sastoji se iz dva dela. Prvi deo ini prethodni ogled koji podrazumeva termiku obradu odgovarajueg razreenja uzorka i inkubaciju na sulfitnom agaru na temperaturi 37 oC u toku 3-5 dana. Drugi deo se sastoji od potvrdnog i zavrnog ogleda. Procedura

izolovanja, identifikacije i kvantifikacije sulfitoredukujuih klostridija, odnosno vrste C. perfringens prema EU metodi podrazumeva zasejavanje u duplom sloju TSC (triptoza sulfit cikloserin) agara (slika ). Podloga se inkubira anaerobno na 37 oC tokom 202 h, nakon inkubiranja prebroje se crne kolonije u podlozi. Najmanje pet crnih kolonija sa TSC-a se gaji na dva krvna agara jedan se inkubira aerobno, a drugi anaerobno na 37 C 18-24 h (McIntosh lonac i Anaerocult). Odsustvo rasta kulture pod aerobnim uslovima je potvrda nalaza sulfitoredukujuih klostridija. Identitet se potvruje ispitivanjem redukcije nitrata, pokretljivosti elija, usvajanja laktoze i likvefakcije elatina. Bakterije koje daju crne kolonije na TSC agaru, nepokretne su, redukuju nitrat, produkuju kiselinu i gas iz laktoze i razlau elatin u toku 48 h se smatraju vrstom C. perfringens.

BACILLUS BACILLUS CEREUS Bacillus vrste su meu najrasprostranjenijim bakterijama u prirodi, nalaze se u zemljitu, praini, prirodnim
i otpadnim vodama, na biljkama, organskim materijalima, u namirnicama, naroito cerealijama, suenim proizvodima biljnog porekla, zainima... Izolovan je iz stolice 15% zdravih ljudi. Bacillus sp. su sporogene aerobne i fakultativno anaerobne, tapiaste, G(+) bakterije. tapii su krupni, neki su i meu najveim bakterijama uopte. Veina vrsta je pokretna, snabdevena peritrihijalnim flagelama, dok su samo neke vrste nepokretne. Tipini nepokretni predstavnik je B. anthracis. Sve Bacillus vrste su katalaza pozitivne bakterije, ali oksidaza varijabilne. Endospore su centralne ili subterminalne, po obliku ovalne ili okrugle, ne deformiu elije, mada u nekih vrsta spore mogu biti veeg dijametra od irine elija. Do produkcije endospora dolazi samo u prisustvu kiseonika. Spore karakterie termorezistentnost koja je razliita kod pojedinih vrsta. Najviu rezistentnost imaju spore B. stearothermophilus, koje opstaju vie minuta na 121 C. Jedini pravi patogeni predstavnik roda Bacillus za oveka je B. anthracis, uzronik antraksa. Ostale Bacillus vrste su generalno saprofiti. Usled proteolitike, saharolitike ili lipolitike aktivnosti pojedine vrste su veoma frekventni uzronici kvarenja razliitih proizvoda, posebno od mesa, mleka, mlinskih i pekarskih proizvoda. B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis su uslovno patogene vrste i mogu biti uzronici alimentarnih toksikoinfekcija. B. subtilis, osim alimentarnih toksikoinfekcija, uzrokuje infekcije koe i sluzokoe (naroito oiju). Ona oboljenja najee su profesionalnog karaktera (osoba koje su u kontaktu sa prainom, biljnim materijalima, slamom i senom). Intersantna je grupa B. subtilismesentericus koje izazivaju karakteristino kvarenje unutranjosti hleba (konavost ili krompirovu bolest hleba). Zdravstveni znaaj imaju toksikogeni sojevi Bacillus cereus. Postoje dve vrste enterotoksina koje mogu da produkuju sojevi i koji izazivaju dva razliita oblika oboljenja. Dijarejalni enterotoksin i emetini enterotoksin. Zabeleena su trovanja kuvanim pirinem, itaricama, pudingom, supama, jelima od povra, mesa, posebno gde su korieni zaini za njihovu pripremu. U Maarskoj se masovne alimentarne toksikoinfekcije izazvane ovom bakterijom povezuju sa obilnim korienjem zaina u pripremi hrane. Optimalna temperatura rasta je 28-35 oC, minimalna je 5 oC a maksimalna 45-55 oC. Osetljivost na pH: min. 4,35 max. 9,3. Prema osetljivosti na aktivnost vode, (aw) min. 0,95. Izolovanje i identifikacija B. cereus vri se na sledei nain. Odgovarajue razreenje uzorka se prvo termiki tretira, zatim povrinski zaseje na MYP agar (manitol umance polimiksin B) i inkubira na temperaturi 30 oC tokom 24-48 h pod aerobnim uslovima. Uoava se rast krupnih (d=37 mm), ruiastih kolonija neravnih ivica, koje su okruene prosvetljenom zonom usled lecitinazne aktivnosti, to ukazuje na prisustvo B. cereus. Veina ostalih Bacillus vrsta su manitol pozitivni, pa su im kolonije ute boje i bez zone prosvetljenja jer ne produkuju lecitinazu. Najmanje pet karakteristinih kolonija preseje se na krvni agar i inkubira na temperaturi 30 C tokom 18-24 h pod aerobnim uslovima. B. Cereus daje pozitivnu reakciju hemolize ( hemoliza). Oko kolonija na krvnom agaru javlja se potpuno ista zona. Potvrdni test dobija se fiziolokim ispitivanjima redukcije nitrata, fermentacije glukoze, likvefakcije elatina i katalaza testom. Bacillus cereus je katalaza pozitivan, redukuje nitrate, anaerobnom razgradnjom glukoze menja boju podloge u utu, ne oslobaa gas i otapa elatin.

LISTERIA MONOCYTOGENES
Fakultativno anaerobni, asporogeni, G(+) kratki tapii. Flagelarno pokretni na 22 oC, nepokretni na 37 oC. Rod Listeria obuhvata 6 vrsta od koji je zdravstvo znaajna samo jedna. Listeria (u ast lorda Listera, engleskog hirurga); monocytogenes znai produkcija monocita tj. sposobnost inficiranja krvnih elija. 110% ljudi mogu sadrati u crevima L. monocytogenes. Bakterija je otkrivena kod sisara, ptica, nekih vrsta riba i ljuskara. Moe se izolovati iz zemljita, silae i drugih prirodnih okruenja i industrijskog bilja. Prema mestima izolovanja povezana je sa sirovim i pasterizovanim mlekom, sirom, sladoledom, sveim povrem, fermentisanim sirovim kobasicama, sirovim i kuvanim ivinskim mesom, sirovim mesom i sirovom i dimljenom ribom. L. monocytogenes je dovoljno rezistentna na efekte zamrzavanja, suenja i zagrevanja, iznad granica oekivanja za asporogene bakterije. Moe da raste na temperaturi nioj od 0 oC, to doputa umnoavanje u hrani iz friidera. L. monocytogenes se razmnoava na temperaturama izmeu 0 i 45 C. Skladitenje smrznute hrane na 18 C tokom 6 meseci, ne dovodi do znaajne redukcije broja vijabilnih elija. Prisustvo L. monocytogenes na trupovima ivotinja najee se pripisuje fekalnoj kontaminaciji. Kontaminacija mleka preko facesa ili vimena obolele ivotinje. Ostaci hrane na opremi, biofilmovi, radnici, vazduh, insekti i glodari mogu biti izvor kontaminacije u pogonu. Smatra se da naroito veliki rizik nosi organski proizvedeno voe i povre. L. monocytogenes izaziva listeriozu, koja se manifestuje kao septikemija, meningitis, encefalitis i intrauterina infekcija ili infekcija grlia materice kod trudnica, koja moe rezultovati u spontani abortus ili mrtvoroenje. Prvi znaci ove bolesti obino prethode simptomima koji su slini influenci, to ukljuuje istrajnu temperaturu. Gastrointestinalni simptomi mogu prethoditi ozbiljnijim oblicima ili mogu biti jedini ispoljeni simptomi. Ukupno gledano mortalitet od listerioze je od 2030% zbog ega listerioze predstavljaju sve vei problem. Ciljna populacija za listeriozu su trudnice, imunokomporomitovane i starije osobe, osobito kada je hrana jako kontaminirana ovim organizmom. Opstaje u kiseloj sredini na pH < 4,3 ali se ne razmnoava. Siretna, limunska i mlena kiselina u koncentracijama od 0,1% kao konzervirajua sredstva mogu da inhibiraju rast ove bakterije. Dugo opstaje u srednje vlanoj hrani sa aw=0,83. Tolerantna je na 6,5% NaCl, neki sojevi se razmnoavaju u prisustvu 10-12% NaCl. Vakuum pakovani proizvodi i proizvodi pakovani u modifikovanoj atmosferi nisu zdravstveno bezbedni po pitanju L. monocytogenes. Podaci o toplotnoj izdrljivosti su razliiti. U sluajevima kada se u proizvodnji kombinuju niske vrednosti aw i toplotna obrada, otpornost na toplotu se poveava, to moe da predstavlja problem. WHO je objavila da je pasterizacija siguran proces koji smanjuje brojnost L. monocytogenes u sirovom mleku, do nivoa koji nee predstavljati rizik po zdravlje ljudi.

L. monocytogenes moe formirati biofilmove na povrini materijala koji su prisutni u industriji, kao to su

elik, staklo, liveno gvoe i plastika. Njen biofilm je najvie izuavan u statinoj kulturi (batch system), kao i inhibicija ili poboljanje rasta L. monocytogenes u biofilmu meane kulture. elije L. monocytogenes biofilma su rezistentnije na 4o amonijumova jedinjenja (quats), anjonske kiseline, hipohlorite, jod, peroksisiretnu kiselinu i fenol, nego planktonske elije. Uz pomo mutanta za flagelin dokazano je da je flagelama olakano rano stanje priljubljivanja na elik. Analiza proteina pokazuje da ih je nekoliko vie ekspresovanih u biofilmu nego u planktonskim elijama. Ovi proteini su ukljueni u globalni metabolizam ugljenika, (oksidativni) stres odgovor, DNK oporavak i zatitu, i elijsku deobu. U mikrobiolokim zahtevima trai se odsustvo u 25 g uzorka hrane, uz prethodno obogaenje. Postupak izolovanja i identifikacije L. monocytogenes se izvodi tako to se prvo vri homogenizacija 25 g uzorka sa 225 ml half Fraser broth. Inkubira se na 30 oC tokom 24 h. Nakon toga se 1 ml obogaenog half Fraser broth-a prenese u 10 ml Fraser broth-a i inkubira se na 37 oC tokom 48 h. Ostatak iz half Fraser broth-a se zasejava na selektivne podloge, Oxford agar (aerobno) ili Palcam agar (mikroaerofilno) i inkubira na 30 ili 37 oC tokom 48 h. Isto tako se vri i zasejavanje sa Fraser broth-a. Podloge se pregledaju nakon 24 h na prisustvo karakteristinih kolonija. Listeria spp. hidrolizuje eskulin u eskuletin i daje crnu zonu oko kolonija. Nakon 48 h inkubiranja sivo-zelene kolonije su prenika 2-3 mm sa centralnim udubljenjem.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Rod Staphylococcus pripada familiji Micrococcaceae,a obuhvata vrste S. aureus, S. epidermidis,S. intermedius, S. saprophyticus... To su G(+) koki bakterije, nepokretne, formiraju grozdove (ali sa vrstih

podloga), fakultativni su anaerobi. Na krvnom agaru daju zonu hemolize (), katalaza su pozitivne. Naziv izveden od grke rei "staphyle" to znai groe i "coccus" to znai zrno ili bobica. Ime roda oznaava klastere koji lie na groe i formiraju se tokom rasta; aureus znai zlatan to oznaava utu boju kolonija S. aureus na vrstim podlogama. Jedan je od najeih uzronika alimentarnih toksikoinfekcija. Nalazi se u praini, vazduhu, vodi, mesu, mleku i mlenim proizvodima, pekirima, odei, opremi i alatima. Hrana koja je uestalo kontaminirana stafilokokama i est je uzronik trovanja ukljuuje mesne proizvode, ivinske i proizvode od jaja, salate, pekarske proizvode, punjenja za sendvie, mleko i mlene proizvode. esto je izvor stafilokoknog trovanja hrana koja zahteva znaajni runi rad tokom pripreme i nestruna manipulacija hranom, nepravilno hlaenje i podregavanje ranije pripremljene hrane, uvanje vie sati pri temperaturama iznad 20 oC. Ljudi koji rukuju hranom su obino glavni izvori kontaminacije namirnica i izbijanja trovanja, ali i oprema i radne povrine mogu takoe biti izvori kontaminacije sa S. aureus. Ljudi i ivotinje su primarni rezervoari stafolokoka. Stanovnik je gornjih respiratornih organa i koe. U ljudskoj populaciji svaka trea osoba ima S. aureus asimptomatski u nosu, kao zdrav kliconoa. Upravo je est izvor zaraze nos i nazofaringealni sekret. ovek je glavni izvor kontaminacije ivotnih namirnica enteropatogenim S. aureus.

S. aureus se razmnoava na temperaturama izmeu 6 46 oC (optimalna je 30 37 oC), a toksine stvara

izmeu 10 i 45 oC (maksimalno izmeu 35 i 37 oC). Pod aerobni uslovima min. pH za razmnoavanje i sintezu toksina je 4,2 a minimalna aw je 0,830,86. Ova bakterija je otporna na poviene temperature, na 60 C opstaje 1 h. Naena je na odmrznutoj hrani, to znai da moe da ostane dugo vijabilna u uslovima skladitenja smrznutih proizvoda -18 C. Pokazuje veliku toleranciju prema NaCl i eeru (halofilan i osmofilan), zbog ove osobine vrlo brzo se razmnoava u slanim i slatkim proizvodima. Otporna je i na isuivanje.

S. aureus proizvodi niz endotoksina i egzotoksina od kojih su najznaajniji enterotoksini (oznaeni sa AF).

70 80% stafilokoknih trovanja vezano je za enterotoksin A. Izazivaju povraanje, bolove u stomaku, groznicu. Enterotoksini su termostabilni, otporni prema temperaturi od 100 C a ostaju neoteeni 20 min. na 120 C. Ostaju u hrani nakon tretmana toplotom iako su elije unitene. Prisustvo toksina utvruje se ELISA testom. Riskantne koliine toksina S. aureus nastaju kada je broj prisutnih elija u hrani 105 elija/g. Postoje okolnosti gde je nemogue izbei prisustvo toksin produkujuih bakterija S. aureus (neke vrste sireva i fermentisana mesa) i Bacillus cereus (pirina, skrobovi, itarice) gde je onda potrebno spreiti umnoavanje elija i produkciju toksina podeavanjem temperature i vremena uvanja. Ostala oboljenja gnojne infekcije: apscesi (lokalna gnojna upala koja se moe razviti u potkonom tkivu, ali i u dubokim tkivima i organima, irevi, stafilokokna angina, mastitis... Radnici koji su bolesni (respiratorna infekcija), ili imaju ireve, ili apscese na koi ne smeju da budu u kontaktu sa hranom. Vrste roda Staphylococcus brzo stiu rezistenciju na brojne antibiotike. Zbog toga je terapiju bolje sprovoditi prema rezultatima antibiograma nego prema doktrinarnim stavovima. Ukoliko zbog hitnosti ne moe da se saeka rezultat antibiograma, u terapiji stafilokoka se preporuuju penicilinaza-rezistentni antibiotici: meticilin, nafcilin i izoksazolil penicilini. Kako se, meutim, u poslednje dve dekade pojavljuju sojevi rezistentni na navedene lekove, kao lek rezerve preporuuje se vankomicin ili neki preparat iz grupe makrolidnih antibiotika. Methicillin-resistentni sojevi Staphylococcus aureus (MRSA) su odgovorni za teke infekcije. MRSA se definie kao svaki soj Staphylococcus aureus koji je razvio rezistenciju na beta-laktamske antibiotike u kojespadaju penicilinski preparati (meticilin, dikloksacilin, nafcilin, oksacilin...) i cefalosporini. MRSA predstavljaju poseban problem u bolnicama gde su pacijenti izloeni operativnim zahvatima, invazivnim dijagnostikim metodama, sa otvorenim ranama i oslabljenim imunim sistemom jer su tako izloeni veem riziku nego opta populacija. Veina studija o formiranju biofilma sa S. aureus je uraena sa povrina predmeta koji se koriste u medicini. S. aureus jedna od glavnih bakterija koja formira biofilmove na protezama, u tim sluajevima izaziva infekcije koje su vrlo teke da se tretiraju antibioticima. Formira

biofilmove na razliitim povrinama, kao to su hidroksiapatit, elik, staklo, i sve vrste plastike kao to su polistiren, polipropilen i silikon. U arnoj kulturi, u formiranom biofilmu je broj elija 5 x 106 do 8 x 107 CFU/cm2 posle 24 48 sati; S. aureus formira biofilm u hemostatu, brojnost varira od 3 x 106 CFU/cm2 posle 4 dana, do 2 x 108 CFU/cm2 posle 13 dana. elije S. aureus-a iz biofilma su rezistentnije na antibiotike, dezinficijense i enzime. Spekulie se da rezistencija prema enzimima moe zavisiti od debljine biofilma. Postojanje rezistencije prema antibioticima moda je zato to je promenjen fizioloki status elija, kao to je promena permeabilnosti membrane, promene u molekulskom cilju antibiotika, indukciji enzima koji degradiraju antibiotike, produkciji egzopolisaharida i sporijem rastu. Prihvaeno je da je sposobnost koagulisanja plazme pouzdan pokazatelj potencijalne patogenosti izolovanog soja. Veina sojeva Staphylococcus aureus prodikuje koagulazu, kao i nekoliko vrsta samog roda Staphylococcus koji mogu koagulisati krvnu plazmu. Postupak izolovanja i identifikacije koagulaza(+) stafilokoka: iz odgovarajueg razreenja uzme se 1 ml inokuluma i zaseje na slani bujon koji sadri 10% NaCl. Inkubira se na temperaturi od 37 oC tokom 24 sata. Nakon toga se vri povrinsko presejavanje na apman i/ili Baird-Parker agar na kojem se inkubacija vri na temperaturi od 37 oC tokom 2448 h. Karakteristine kolonije se ispituju na sposobnost koagulisanja plazme na 2, 4, 6 i 24 h. Na slici je prikazan izgled elija na podlogama za izolovanje: BairdParker agar sadri jo i LiCl i K-telurit radi inhibicije rasta prateih mikroba. Kolonije na ovoj podlozi su crne, konveksne i sjajne, a oko kolonije se obrazuje prozirna zona usled lipolitike i proteolitike aktivnosti. Na podlozi po apmanu, koja je inae crvene boje, kolonije su ute i okruene su utom zonom.

ENTEROCOCCUS
G(+), fakultativno anaerobne koki bakterije koje se nalaze pojedinano, u parovima ili kratkim lancima. Veina sojeva raste na temperaturi 1045 C, optimum je 35 C. Rastu na podlozi sa dodatkom 6,5 % NaCl. Skoro svi sojevi su homofermentativni, bez produkcije gasa. Enterokoke dobro preivljavaju u nepovoljnim uslovima sredine. ,,Fekalni streptokoki upuuje na one streptokoke koje su obino prisutne u izmetu ljudi i ivotinja. Svi poseduju grupni D antigen, tj. elijski zid sadri antigen za glicerol-tejhojnu kiselinu (antigen streptokokne D grupe). Taksonomski rodovi Enterococcus: E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. durans, E. casseliflavus, E. malodoratus, E. avium... i Streptococcus: S. bovisi, S. equinus. Enterokoke su normalni stanovnici intestinalnog trakta sisara i prisutni su u fecesu, ali su takoe sposobni da preive i rastu u velikom varijetetu razliitih okruenja, tako da njihovo prisustvo u hrani nije obavezno indikator direktne fekalne kontaminacije. Prisustvo enterokoka kao indikatora fekalnog zagaenja u vodi je opteprihvaeno, dok za njihovo prisustvo u hrani ne vlada isto miljenje. Znaaj kao agenasa u humanim oboljenjima je u porastu uglavnom zbog njihove rezistencije na antimikrobne agense na koje su druge streptokoke uglavnom osetljive. Testovi in vitro sa enterokokama su pokazali da ovi organizmi imaju MIC vrednosti za penicilin koje su 10100 puta vee nego kod drugih streptokoka. Enterokoke su vani uzronici nazokomijalnih (bolnikih) infekcija u SAD (trei po uestalosti). E. faecalis je najrairenija vrsta povezana sa 8090 % humanih enterokoknih infekcija. E. faecium je drugi po uestalosti izolacije iz 10 15 % infekcija. Ostale vrste enterokoka, ukljuujui E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum, E. raffinosus, E. hirae, E. malodoratus i E. mundtiisu retko izolovani kod humanih infekcija. Ostale vrste su retke kod humanih klinikih uzoraka ili su primarno naene u gastrointestinalnom traktu razliitih ivotinja. Enterokokne vrste uzronici su komplikovanih infekcija urinarnog trakta, bakteriemije, endokarditisa, intraabdominalnih infekcija, infekcija rana i mekih tkiva, neonatalne sepse i ree meningitisa. Faktori koji determiniu patogenost enterokoka nisu najbolje razjanjeni. Neki sojevi E. faecalis i E. faecium produkuju citolizin koji deluje kao hemolizin na eritrocite ljudi, zaeva, konja i goveda, ali ne i na ovije eritrocite. Ovaj citolizin toksian je za izvesne tipove eukariotskih elija. Agregaciona supstanca je na povrinski sa plazmidom vezani kodirani protein koji pomae grupisanje ovih organizama kako bi se olakalo izmenjivanje plazmida. Za ovu supstancu takoe se veruje da ima funkciju u adherenciji na intestinalne i renalne epitelne elije i u sranoj vegetaciji kod eksperimentalnog modela endokarditisa. Sojevi E. facalis takoe produkuju feromone (mali peptidi) - konjugativni transfer plazmidske

DNK izmeu sojeva. Neki sojevi E. faecalis produkuju plazmidom kodirani 7,4 kDa bakteriocin, nazvan AS 48, koji ima litiku aktivnost za iroki spektar G(+) i G() bakterija. Neki sojevi E. faecalis produkuju razliite ekstracelularne enzime kao npr. elatinazu i hijaluronidazu.

E. faecalis najee je izolovan iz humanih klinikih uzoraka i iz humanog gastrointestinalnog trakta.

Takoe naen je i u gastrointestinalnom traktu ivine, stoke, svinja, pasa, konja, ovaca i gusaka. E. faecium naen je najee kod humanih klinikih uzoraka. Uglavnom je vie rezistentan na antimikrobna sredstva u odnosu na E. faecalis. Naen je u gastrointestinalnom traktu razliitih vrsta ivotinja. E. avium izolovan je iz ptica, pasa i humanog gastrointestinalnog trakta. E. durans retki su kliniki izolati, a ee se mogu nai u mleku i mlenim proizvodima. E. casseliflavus otkriven je na biljkama, u zemljitu i retko u fecesu pilia, a klasifikovan je kao podvrsta E. faecium. Produkuje uti pigment, elije su pokretne, oportunistiki je agens u humanim infekcijama. E. galinarum izolovan je iz fecesa pilia, jedan je od dva pokretna enterokoka. Takoe je naen i kod pacijenata na hemodijalizi. E. malodoratus izolovan je iz gauda sira i nepasterizovanih mlenih proizvoda. Ime znai ,,miris na bolest. E. mundtii uto pigmentisane kolonije. Izolovan je iz biljaka, zemlje, gastrointestinalnog trakta stoke, svinja i konja. E. hirae uzrokuje smanjenje rasta kod pilia. Izolovan je iz gue i fecesa pilia, iz gastrointestinalnog trakta stoke, svinja, pasa, konja, ovaca, gusaka i zeeva. Tipski soj (E. hirae ATTC 8043) ima kompleksne nutritivne zahteve i koristi se u industriji hrane kao organizam za bioloki ogled za aminokiseline i vitamine.

ESCHERICHIA COLI
Theodor Escherich je prvi opisao E. coli (1885. god.) kao Bacterium coli commune, a izolovao ju je iz fecesa bebe. Dugo vremena je ova vrsta smatrana kao komensalni organizam debelog creva ("enterina bakterija). Do 1935. godine nije izolovan soj koji izaziva dijareju, osim kod beba. Najvie i najbolje ispitana enterina bakterija mada su, po zdravstvenom znaaju, meu njima mnogo vanije vrste roda Salmonella izazivai tifusne groznice i Shigella vrste izazivai dizenterije.

E. coli pripada familiji Enterobacteriaceae, to su G(), asporogene, tapiaste, flagelarno pokretne

bakterije. Veina sojeva dobro raste u laboratorijskim uslovima, u prisustvu/odsustvu kiseonika to znai da im je metabolizam prilagoen na respiraciju ili fermentaciju. Komensalni E. coli sojevi debelog creva ljudi i toplokrvnih ivotinja ine oko 1% ukupne bakterijske mase u toj sredini. Ove populacije E. coli odravaju konstantan fluks. Najei izvor novih serotipova je preko oralnog unoenja. Ugljene hidrate razlae uz stvaranje gasa i kiseline, ima lipolitiku aktivnost, a ponekad i proteolitiku (trulenu). Optimalna temperatura razmnoavanja je 37 C, mada se razmnoava i na 45 C, i na niim od 4o C. Lako se unitava toplotnim tretmanima koji se koriste u prehrambenoj industriji, na 60o C unitava se za 15 min, a na 90o C za 4 min. Minimalan pH za rast je 4,3. Umereno je osetljiva prema NaCl. E. coli O157 se unitava kuvanjem ukoliko se u svim delovima hrane postigne temperatura 70o C i vie. Identifikovano je vie od 700 serotipova na osnovu O (somatski) i N (flagelarni) antigena. Crevna oboljenja su uzrokovana alimentarnim toksikoinfekcijama, dok piogena oboljenja izazivaju sojevi koji ive u digestivnom traktu (infekcije urogenitalnog trakta, une kese i vodova, uni kamenac...). Patogeni serotipovi produkuju verotoksin (ili igatoksin) koji predstavlja jedan od najjaih toxina za oveka. CDC (Centar za kontrolu i prevenciju bolesti) ga je proglasio za potencijalno bioloko oruje. Seroloki tipovi E. coli koji izazivaju oboljenja dele se u 5 grupa u zavisnosti od virulentnosti: enterotoksigene (ETEC) sintetiu enterotoksin enteropatogene (EPEC) enteroinvazivne (EIEC) enterohemoragine (EHEC) O157:H7 enteropatogene (EPEC) enteroagregatne (EAggEC).

Samo prve 4 se prenose vodom i hranom, meusobno se razlikuju po patogenosti. Patogeni E. coli sojevi odgovorni su za tri tipa infekcija kod ljudi: infekcije urinarnog trakta, neonatalni meningitis i intestinalna oboljenja. Uropatogene E. coli izazivaju 90% UTI kod anatomski obinih ljudi, preko fecesa i perinealnog regiona; 14 puta ee kod odraslih ena. Znaajan je izaziva dijareja kod beba i putnika u nerazvijene zemlje i krajeve sa loim sanitarnim uslovima. Simptomi mogu biti od minornih do problema slinog sindromu kolere. Dobija se unoenjem kontaminirane hrane i/ili vode, nakon ega dolazi do kolonizacije i nastajanja jednog ili vie plazmidno kodiranih enterotoksina. Produkovani enterotoksini mogu biti termolabilni (LT) ili termostabilni (ST), to je takoe opet plazmidno zavisno. LT je slian kolera toksinu po strukturi i nainu delovanja. ST je mali peptid (molekulske mase oko 2.000 Da). Dijareja bez groznice se javlja usled kolonizacije bakterija u GIT-u, sa fimbrijalnim adhezinom, i produkcije toksina. Enteroinvazivne E. coli (EIEC) blisko povezane sa Shigella vrstama u smislu mehanizma patogenosti i ispoljavanju bolesti. Prodiru i umnoavaju se u epitelnim elijama kolona izazivajui njihovu iroku destrukciju, ali ne produkuju nikakav toksin. Sindrom kod dizenterije tog tipa je dijareja sa groznicom. Enteropatogene E. coli (EPEC) indukuju vodenastu dijareju slinu ETEC, ali one nemaju kolonizujui faktor. Ne produkuju LT ni ST toksine, njihov adhezin je oznaen kao intimin protein spoljanje membrane koji uestvuje u zavrnoj fazi adhezije. Mogu da produkuju enterotoksin slian igeloznom. Adhezija EPEC je specifian i sloen proces, pa je ak po tome izvedena podela sojeva meu najeim putnikim dijarejama u Meksiku i severnoj Americi. Enteroagregatne E. coli (EAggEC) sojevi su sposobni da napadaju tkiva, izazivaju dugotrajne dijareje kod dece. Adheruju se na intestinalnu mukozu, mogu da produkuju HLT. Produkuju i hemolizin koji je svojstven sojevima koji izazivaju urinarne infekcije. Enterohemoragine E. coli (EHEC) reprezentuje jedan soj (serotip O157:H7) koji izaziva sindrom dijareje razliit od EIEC i Shigella vrsta. Razlika je u tome to je obilno krvava, ali bez temperature i u duem vremenu izaziva toksine efekte na bubrege (hemolitina uremija). EHEC se smatra uzronikom ozbiljnog oboljenja koje je najee povezano sa unoenjem nedovoljno termiki tretiranim jelima tipa hamburgera. Kod dece moe biti fatalna (zbog bubrega). Smatra se umereno invazivnom. Produkuje toksin identian igeloznom. Terapija podrazumeva lizis elija E. coli koje su u procesu deobe u prisustvu -laktamskog antibiotika. Poznato je da su neki -laktamski antibiotici (npr. ampicilin i cefalosporin) efikasni u tretmanu meningitisa izazvanog sa E. coli. -laktamski antibiotici ometaju sintezu elijskog zida, koji tako postaje sve slabiji i dovodi do rupture ili lizisa.

SALMONELLA Salmonella vrste su G(+), fakultativno anaerobne, tapiaste bakterije. Pripadaju istoj familije kao Escherichia coli, tj. pripadaju familiji Enterobacteriaceae, trivijalnog naziva "enterine" bakterije. Salmonele su skoro isto ispitivane kao E. coli po pitanju strukture, biohemije i na molekulskom nivou, ali su jo

oskudna znanja o ekologiji. ive u intestinalnom traktu ivotinja. Neke vrste su ubikvitarne, dok su ostale specijalizovane, tj. adaptirane na posebnog domaina. Salmoneloze koje izazivaju su: enterina groznica (tifus, paratifus), izazivaju je invazivni sojevi koji prodiru u krv, i akutni gastroenteritis koji nastaje unoenjem inficirane/intoksicirane hrane. Klasifikacija salmonela zasnovana je njihovom antigenom sastavu. Postupak odreivanja antigena naziva se serotipizacija. Salmonella vrste imaju etiri vrste antigena, od kojih su trei i etvrti retko zastupljeni: Somatski O antigen je glikolipidopolisaharid koji je sastavni deo elijskog zida i istovremeno termostabilan endotoksin. Flagelarni H antigeni su termolabilni jer su proteinske prirode, predstavljaju specifine antigene salmonela. Antigen Vi ili ovojni antigen (Vi potie od virulencije) se unitava dvoasovnim kuvanjem. Fimbrijalni antigeni su veoma retki. U praksi se ne koriste zvanini nazivi za vrste i podvrste, nego se imena serotipova koriste kao imena vrsta. Salmoneloze izaziva preko 2200 serotipova salmonela. Manifestuju se poremeajima u GIT-u, simptomi mogu biti opti, kao to su abdominalni bol, groznica, muka, povraanje i dijareja; i posebni poput dehidratacija organizma, glavobolja i pojava krvi u stolici. Bojenje flagela Salmonella typhi je slino kao kod

E. coli. Salmonella vrste su pokretne peritrihnim flagelama, vrlo su sline Shigella vrstama jer izazivaju enterine infekcije. Rod Salmonella prema najnovijoj taksonomiji sadri samo dve vrste: S. enterica (6 podvrsta) i S. bongori. Sa zdravstvenog aspekta najznaajniji su serotipovi S. enterica: typhi, paratyphi A i C, enteritidis, typyhimurium, newport i stanley.
Otporne su na niske temperature i isuivanje, opstaju i u smrznutoj hrani, ali su manje otporne na visoke temperature od E. coli. 3-4% NaCl deluje inhibitorno, a koncentracije iznad 9% baktericidno. Minimalan pH za opstanak je 4,5. Imaju bogat ugljenohidratni metabolizam, saharolitike su bakterije. Produkuju H2S. Jedan od najvanijih rezervoara salmonela je ivina, odakle dospevaju u meso i jaja. Najee se povezuju sa kontaminacijom jaja: 1994. godine obolelo je vie od 224.000 ljudi u velikoj epidemiji salmoneloze, iji je uzronik bila S. enteritidis poreklom iz sladoleda proizvedenog od mleka koje je transportovano vozilom u kojem se prethodno nalazio melan. Za razne kremove i namaze koriste se svea jaja, termiki neobraena jaja su siguran put za unos ovih bakterija. Izolovane su i iz okolada u kojima je izvor kontaminacije bio kakao zrno, zatim iz suenog kokosa i pudinga. Poslednjih godina belei se sve vei broj sluajeva trovanja preko kontaminiranog voa i povra. eer i so ne predstavljaju pogodnu sredinu za razmnoavanje salmonela, ali se one mogu pasivno odravati dok se ne steknu odreeni uslovi. Poetkom XIX veka je sa klinikim znacima i simptomima definisan tifus, iz tog vremena se enterina groznica definie kao tifusna. 1880. godine Eberth je prvi zapazio i opisao tifoidni tapi. Robert Koch je potvrdio to otkrie i zajedno sa Gaffky uspeno kultivisao elije 1881. godine ali dalja ispitivanja nisu bila mogua. 1896. godine pokazano je da se serum iz ivotinje, koja je imunizovana sa ovakvom bakterijom, aglutinira odn. spaja sa bakterijskim elijama. To je posredan dokaz za pacijenta, odn. poetak seroloke dijagnoze za salmonele. DNK sastav je 50-52 mol% G+C, to je vrlo slino sa rodovima Escherichia, Shigella i Citrobacter, a velika slinost je potvrena i numerikom taksonomijom kao i 16S ssRNK analizama. Nomenkaltura salmonela je kontroverzna u odnosu na originalni taksonomski pristup, nazivi vrsta i meusobna veza nisu na bazi DNK slinosti ve na osnovu klinikih ispoljavanja: Salmonella typhi, Salmonella cholerae-suis, Salmonella abortus-ovis... U Kauffmann-White emu su ugraene seroloke analize (1946 god.) pa su vrste specifino opisane, tako da su serovari su postali vrste. S. typhi-murium, S. cholerae-suis su u sutini ubikvitarni. esto su nazivi davani po geografskoj odrednici gde su prvi put izolovani: S. london, S. panama, S. stanleyville.

SHIGELLA
Pripada familija Enterobacteriaceae. Rod Shigella podrazumeva G(), fakultativno anaerobne, nepokretne, asporogene bakterije. Seroloki su sline E.coli, serotipizacija se vri na osnovu njihovih somatskih O antigena. Sve etiri vrste roda Shigella: S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (najblaa forma) i S. dysenteriae (tip 1) produkuje igelozni toksin, izazivaju dizenteriju ili igelozu (krvav feces sa intestinalnim bolovima). elije napadaju epitelni sloj ali ne penetriraju u njega, obino posle 2-3 dana dolazi do dizenterije kao rezultata oteenja sloja, esto sa oslobaanjem mukoze i krvi uz leukocite. Meutim vodenasta dijareja se esto javlja bez ostalih znakova. igelozni toksin je hromozomski kodiran, pripada neurotoksinima, kao i entero- i citotoksinima. Inhibira sintezu proteina delujui na 70S ribozome i lizirajui 28S rRNK. Njegova uloga u patogenezi je nesigurna jer toksinski negativni mutanti i dalje izazivaju bolest. igeloza je primarno deija bolest koja se dobija fekalno-oralnim kontaktom. Odrasli ih mogu dobiti od dece, mada se moe dobiti i inficiranjem hrane od strane kliconoa (istoa ruku). Ljudi i impanze su jedini rezervoari. Bakterije roda Shigella su rasprostranjene irom sveta, igele se prenose sa osobe na osobu, ali ne smeju se zaboraviti mogui kanali preko kontamirane vode i hrane. Epidemije igeloze se javljuju u prenaseljenim sredinama, gde osobe prenosioci postoje u odreenim okolnostima. Poto je bolest uestalija u periodu godine kada su najbrojniji letei insekti, smatra se da se infekcija moe iriti i tim putem. Mali inokulum S. sonei ili flexneri (do 100 mikroorganizama) je dovoljan da uzrokuje infekciju. Oko 10 elija S. dysenteriae mogu uzrokovati kliniki manifestnu bolest. Oko 14.000 laboratorijski potvrenih sluajeva igeloze i procenjenih 448.240 (veina S. sonei) se javljaju u SAD svake godine; zbog mnogih lakih sluajeva koji nisu dijagnostikovani i prijavljeni, aktuelni broj infekcija moe biti i 20 vei. U zemljama u

razvoju S. flexneri predominira, epidemije izazvane sa S. dysenteriae (tip 1) javljaju se u Africi i Centralnoj Americi sa stepenom smrtnosti 5-15%. Shigella dysenteriae su odgovorne za 60% svih sluajeva akutne dijareje kod dece u Indoneziji i Indiji

PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Rod Pseudomonas spada u familiju Pseudomondaceae i obuhvata 30 vrsta. Pseudomonas aeruginosa je G(), aerobna, asporogena, pokretna, tapiasta bakterija. Javlja se pojedinano, u paru ili kratkim lancima. Premda su vrste roda Pseudomonas veinom striktni aerobi, P. aeruginosa je fakultativno anaerobna bakterija. Katalaza i oksidaza je pozitivna, produkuje dva pigmenta: piomicin i fluorescin. P. aeruginosa ivi u vlanom zemljitu, na biljkama, otpadnim i povrinskim vodama, u vodama bazena, na vlanim predmetima i namirnicama. Najvie je izolovan kao kontaminant iz mleka i mlenih proizvoda. Moe se pronai i na sapunima, u slabim antiseptikim rastvorima, ureajima za vlaenje vazduha, ventilaciju i klimatizaciju, na vlanim instrumentima i moe predstavljati veliki problem u medicinskim ustanovama i pogonima prehrambene industrije. Usled velike rasprostranjenosti u prirodi i rezistentnosti prema hloru, P. aeruginosa veoma lako moe dospeti i opstati u vodovodnoj mrei i u vodi za pie. Brojne pseudomonade su biljni patogeni, sa 2 vrste koje su reklasifikovane u rod Burkholderia ini grupu humano patogenih. U higijeni ivotnih namirnica mnoge vrste pseudomonada su znaajne kao uzronici kvarenja namirnica, sirovog mesa, jaja, mleka, maslaca i sireva. Meu njima se istiu P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putrefaciens i dr. Ove bakterije su lipolitine i proteolitine, stvaraju sluzavost, izazivaju proteolizu i ueglost masnog tkiva i pigmentaciju na povrini namirnica.

P. aeruginosa uzrokuje irok spektar raznih infekcija (pseudomonijaze) koja posebno dobijaju znaaj u

poslednje vreme, kao posledica iroke upotrebe antibiotika u terapiji i pojave sve rezistentnijih sojeva. Pseudomonas aeruginosa je oportunistiki patogen koji izaziva infekcije urinarnog i respiratornog, gastrointestinalnog trakta, dermatitis... Izrazito rezistentan na brojne antibiotike. Izaziva infekcije rana, srednjeg uha, zapaljenja korneje oka i neke piogene infekcije (meningitis, endokarditis). Naroito se poveao znaaj ove bakterije kao uzronika intrahospitalnih infekcija. U leenju infekcija se koriste toksini antibiotici, karbenicilin, gentamicin, polimiksin B ili kombinacija ovih antibiotika. Moe uzrokovati alimentarne toksikoinfekcije, gastroenteritise i enteritise koji lie na dizenteriju i enteritise izazvane salmonelama (najee u odojadi i male dece), este su epidemije u tropskim predelima. Izolovanje i identifikacija Pseudomonas aeruginosa se vri tako to se 1 ml odgovarajueg razreenja zaseje na Cetrimid agar i inkubira na temperaturi od 25 oC tokom 48 h. Nakon toga se izvodi oksidaza test, pri kojem se oksidaza (+) kolonije ubodom zasejavaju u duboki glukozni agar i inkubiraju na 25 oC tokom 24 h. Bez promene boje podloge ili mala promena boje po povrini agara je potvrda Pseudomonas spp.

CAMPYLOBACTER
Postaje glavni zdravstveni problem koji potie od mikroorganizama iz hrane. U tehnoloki razvijenoj zemlji kao to je Kanada, prijavljeno je do sada oko 2,2 miliona sluajeva i procena je da je to troak (izgubljeni radni sati, trokovi leenja) na nivou drave od oko 1-2 milijarde dolara. U SAD je registrovano preko 89 miliona sluajeva, a ak se 9.000 smrti povezuje sa ovim uzronikom. Bakterije roda Campylobacter (15 vrsta) pripadaju porodici Campylobacteriaceae to su tanki, asporogeni, G() savijeni tapii, S-oblika ili spiralno zakrivljeni. Veina bakterija roda Campylobacter je adaptirana na crevni trakt toplokrvnih ivotinja. Veruje se da su galebovi glavni nosioci Campylobacter spp. Pored toga, znaajno stanite su ivotinje, naroito perad, pa su verovatno oni krajnji izvor veine infekcija kod ljudi. Campylobacter vrste se javljaju u mnogim okruenjima, dokazano je da su sposobne da preu u odrivo, ali umrtvljeno stanje, da bi izdrale nepovoljne uslove. U poslednjih 20 godina Campylobacter jejuni je prevaziao Salmonella spp. i postao najei izaziva oboljenja dobijenih preko hrane. C. jejuni izaziva gastroenteritis koji dovodi do GuillianBarre sindroma i reaktivnog artritisa. ivina i sirovo mleko su njegovi glavni izvori.

C. enteritis je najei oblik infektivne dijareje u najrazvijenim zemljama sveta. Veruje se da C. jejuni stvara
crevni toksin slian kolerinom toksinu, najsimptomatinije infekcije javljaju se kod beba i u ranom detinjstvu. Kliniki simptomi C. jejuni infekcije karakteriu grevi, abdominalni bol, dijareja, drhtavica i groznica, koji su samoogranieni i nestaju za 3 do 7 dana. Veina kampilobakterioznih infekcija zahteva tretman, upotrebom antibiotika skrauje se period u kom oboleli izbacuju bakterije putem stolice. U prenoenju C. jejuni sa ivotinja na ljude posebnu ulogu imaju namirnice animalnog porekla. Glavni izvor infekcje ljudi predstavljaju nedovoljno termiki obraene namirnice ili namirnice spremne za konzumiranje kontaminirane sa sirovim sastojcima.

Oko 1/3 ivinskog mesa u prometu kontaminirana je ovim bakterijama. Svinje su ee rezervoar C. coli nego C. jejuni. Sirove kobasice mogu biti kontaminirane ako se za punjenje koriste svea, nedovoljno pripremljena creva. Kontaminacija svinjskih polutki je mnogo ea od kontaminacije trupova goveda ili ovaca. Campylobacter jejuni/coli kod ljudi izaziva akutne enteritise sa razliitom klinikom slikom od blagih dijareja do profuznih krvavih dijareja i bolova u abdomenu. Kod ovaca i krava izaziva abortuse, a nastanjuje se u crevima vidljivo zdravih krava, ovaca, peradi i drugih domaih ivotinja. Kontaminacija mleka kampilobakterom nastaje indirektno od inficiranih krava koje fekalnim putem izluuju ovaj mikroorganizam, ali kontaminacija moe nastati i direktnim putem u sluaju asimptomatskog mastitisa uzrokovanog ovim mikroorganizmom. Veina istraivaa navodi da se kampilobakter retko izoluje iz mleka, a da je glavni put kontaminacije fekalni put od inficiranih krava. Kampilobakterioze nastale nakon konzumiranja sirovog mleka opisane su u SAD, Engleskoj, Velsu, kotskoj i Kanadi. Kampilobakterije mogu prouzrokovati i upalu slepog creva ili inficirati abdominalnu upljinu (peritonitis), srce (carditis), centralni nervni sistem (meningitis), uni mehur (holecistis), urinarni trakt i krvotok. Moe prouzrokovati i sepsu opasnu po ivot kod osoba sa kompromitovanim imunim sistemom. Druge klinike manifestacije C. jejuni infekcije kod ljudi ukljuuju septini artritis i meningitis. Smrtni sluajevi zbog C. jejuni uglavnom se javljaju kod beba i starijih osoba. Infekcija se javlja kao posledica konzumiranja mesa ili vode zagaene telesnim izluevinama inficiranih ivotinja. Zabeleen je fekalno-oralni prenos i prenos C. jejuni sa osobe na osobu. Poetno mesto kolonizacije bakterija je gornji deo tankog creva. C. jejuni se razmnoava u ljudskoj ui. Bakterija se kolonizuje u jejunumu, ileumu i kolonu. Humane volonterske studije su pokazale da je infektivna doza sadri izmeu 500 i 1000 mikroorganizma, iako najprirodnije infekcije najverovatnije zahtevaju najmanje 104 mikroorganizama.

CANDIDA ALBICANS
Oportunistiki fungalni patogen koji je prisutan u uobiajenim mikrobnim populacijama ljudskog tela; normalna flora gastrointestinalnog trakta i esto se moe nai na koi i sluzokoi usta i vagine. Imunoloki sistem normalno kontrolie aktivnost kandide. Moe da izazove bolest u sluaju pada odbrambenih snaga domaina ili u sluaju disbioze, na primer zbog dugotrajne antibiotske terapije. Najei oblici su kandidijaze sluzokoe usta, vaginitis, onihomikoza i dermatitis. Antibiotska i/ili imunosupresivna terapija, kao i imunosupresivna oboljenja (dijabetes, leukemija i AIDS) mogu dovesti do ozbiljnih sistemskih infekcija koje zahvataju kou, plua, srce i druge organe. Kandidi se pripisuje 10% od svih sluajeva septikemije. Sojevi ispoljavaju razliite virulentne faktore koji pomau kolonizaciju i perzistenciju u telu. Meu najznaajnijim faktorima je sposobnost da se adheruje na ljudska tkiva koristei razliite mehanizme (znaaj toga se moe ilustrovati sposobnou da adheruje razne mukozne povrine sa izdrljivom silom to ne dovodi do uklanjanja iz tela sa delovanjem tkivnih tenosti. Najei etioloki agensi kandidioza (C. albicans i C. tropicalis) se bolje adheruju in vitro na naa tkiva nego C. krusei i C. gulliermondii. Adherovanje na tkiva je potpomognuto kombinacijom specifinih i nespecifinih mehanizama. Specifina je interakcija ligand-receptor, a nespecifine su elektrostatike sile, agregacija i hidrofobnost povrine. Nespecifine interakcije su primarno (deavaju se na veim razdaljinama) ukljuene u adherencu i reverzibilne su; meutim, mogu se smatrati i ireverzibilnim jer odmah deluju i specifini mehanizmi koji ukljuuju sposobnost kvasca da prepozna razlike u receptorima elije domaina. C. albicans se javlja u dve morfoloki razliite forme pupajue blastospore ili hife; mogu prelazak i obino se zapaaju obe forme u

tkivima. Hife imaju sposobnost tigmotrofizma (osetljivosti na kontakt) to im moe pomoi u otkrivanju putanja sa najmanjim otporom izmeu slojeva elija u tkivu. Produkuje neke ekstracelularne enzime koji olakavaju adherencu i/ili prodiranje u tkivo; fosfolipaze (A, B i C) i lizofosfolipaze mogu uestvovati u oteenju membrana elija domaina i olakavati invaziju. Morfologija Candida albicans: A blastospore B hife C prelaz u hifu D prelaz u pseudohifu Produkuje neke kisele proteinaze koji pomau adherencu i invaziju, a takoe su znaajni u degradaciji imunoglobulina IgG i IgA. Sa niskim su pH optimumom i mogu pomagati u kolonizovanju npr. vagine. Dokazano je da produkuju hemolizin koji dovodi do oslobaanja Fe iz oteenih eritrocita, koji je esencijalan za njihov rast. Znaajna taktika imunog izbegavanja je sposobnost da se veu u platele (povezane elije u grupice) preko fibrinogen-vezujuih liganada. Sposobni su da daju razliite interizmenljive fenotipove za koje se smatra da su vani u obezbeivanju velikog broja virulentnih faktora. Posle adherence mogua je transformacija u hife koje prodiru. Njegove endotelijalne elije su bogate enzimima koji potpomau degradaciju tkiva i dospevaju do krvotoka, gde se fenotipski prebacuju uz mogue prevlaenje u platele mogue je da se koriste za izbegavanje imunog sistema. Beanje iz krvotoka ukljuuje adherencu na zidove kapilara i prolazak kroz njih.

ASPERGILLUS FUMIGATUS
Saprofitna plesan iroko rasprostranjena, koja se esto nalazi na vlanim povrinama i biljkama koje trule. Moe postati oportunistiki patogen uobiajen etioloki agens plune aspergiloze (80-90% sluajeva). Vei je nivo mortaliteta nego kod C. albicans (ree se javlja). Produkuje brojne ekstracelularne enzime koji omoguuju rast u pluima i rasipanje po telu. Kliniki izolati imaju fosfolipaze sa topt. 37 oC kljuni u razgradnji tkiva i mogu olakati prodiranje plesni iz plua u krvotok. Proteaze su odgovorne za degradaciju tkiva i neutralizaciju imunog sistema i verovatno evoluiraju pri prelasku jedinke sa biljnog na ivotinjski materijal. U plunom tkivu elastin je sadran sa oko 30%, a plesan pokazuje elastinolitiku aktivnost, dok su izolati nesposobni da je ispoljavaju i pokazuju redukovanu virulenciju prema mievima. Produkuju dve elastinaze: serin proteazu i metaloproteinazu. Osim direktne uloge u degradaciji tkiva, proteaze (osobito serin proteaza) mogu imati ulogu alergena to je znaajno u zapoinjanju i odravanju alergijske aspergiloze. Lokalno zapaljenje zbog prisustva proteaza rezultuje u oteenju prenosa vazduha. In vitro ispitivanja pokazuju da su proteaze sposobne da indukuju odvajanje epitelnih elija od bazalne membrane, indukuju oslobaanje proinflamatornih IL-6 i IL-8 citokina u elijske linije. Produkcija i sekrecija toksina u okolno tkivo je znaajna za virulencu i moe potpomagati fungalni rast u pluima. Gliotoksin je glavni toksin koga produkuju, a pored njega i fumigatin. Smatra se da su toksini znaajni u olakavanju kolonizacije, Aspergillus vrste koje ne produkuju toksine u istom nivou kao A. fumigatus su jako retko izolovani iz bolesnikog materijala. BAKTERIJE INDIKATORI FEKALNOG ZAGAENJA VODE Mikroorganizmi koji se nalaze u vodi svrstani su po svom poreklu u dve grupe: saprofitni mikroorganizmi kojima je voda prirodno stanite kontaminanti vode (mikroorganizmi poreklom iz vazduha, zemlje i drugih izvora) Na osnovu higijenskog znaaja, bakterije koje se najee nalaze u vodi dele se na sledee grupe: saprofitne bakterije uslovno patogene bakterije bakterije indikatori fekalnog zagaenja patogene bakterije

Bakterije indikatori fekalnog zagaenja normalno je da se nalaze u fekalijama i ubretu. Za preciznije podatke o poreklu, karakteru i vremenu fekalnog zagaenja kao sanitarni pokazatelj se koriste bakterije indikatori fekalnog zagaenja, a prisustvo nekih od njih u vodi ukazuje na nedavno zagaenje. Indikatorima fekalnog zagaenja pripadaju Escherichia coli, Clostridium spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Legionella ssp.

Escherichia coli se najee prenosi vodom, namirnicama, predmetima opte upotrebe pa ak i vazduhom. Escherichia coli O157:H7, najznaajniji predstavnik enterohemoragine grupe koji stvara toksin. Prilino su

otporne - mesecima mogu da ive u vodi, otporne su prema niskim temperaturama koje su znatno ispod 0 o C, temperatura od 60 oC ih ubija posle 15 min. Rod Legionella - tipska vrsta je L. pneumophila (prva vrsta koja je opisana). Broj vrsta, podvrsta i serotipova roda Legionella se stalno poveava, a trenutno se zna za preko 50 vrsta i 70 razliitih serotipova. ak 16 serotipova je kod L. pneumophila, po dva kod L. bozemanii, L. longbeachae, L. feeleii, L. hackeliae, L. sainthelensi, L. spiritensis, L. erythra i L. quinlivanii dok je za ostale vrste poznat po jedan serotip. Izolovani iz prirodne svee vode (reka, potoka, jezera i termalnih izvora), zemlje, a ima je u aerosolima. L. pneumophila izaziva legionarsku bolest i pontianu groznicu. Legionele su veliine od 0,3-0,9 x 2-20 m to zavisi od starosti kulture. U mladoj (sveoj) kulturi su kokobacili dugi oko 2-6 m, dok se u starijim kulturama mogu videti filamentozne forme duge do 20 m. Legionele su gram-negativne bakterije sa tankim elijskim zidom. Kolonije L. pneumophila su karakteristine pegavo-zelene ili roze-ljubiaste boje koja se preliva u druge boje. L. pneumophila ima ogranienu pokretljivost, a neki sojevi su nepokretni, mogu da imaju 1-2 polarne flagele. Za razliku od drugih bakterija u vodi, L. pneumophila zahteva soli gvoa i aminokiselinu L-cistein za rast na laboratorijskim podlogama. L. pneumophila ne pokazuje veliku biohemijsku aktivnost. Moe da proizvode vie toksina (endotoksini, hemolizini, citotoksini, toksini koji oteuju makrofage) koji oteuju elije i dovode do nekroze tkiva. Voda esto sadri brojne patogene mikroorganizme iz rodova Salmonella, Shigella, Campylobacter, kao i vrste Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae. Ne postoji idealan bioloki indikator, ali neophodno je ispunjavanje odreenih zahteva: mora da se uvek u velikom broju javlja u fekalijama oveka ne sme da ima drugi izvor sem creva oveka treba da ivi u vodi due nego patogene bakterije, ali ipak treba dosta brzo da prestaje da se razmnoava u vodi koliina indikatora u vodi treba da pokazuje kvantitativni odnos zagaenja indikator treba da ima neke konstantne karakteristike i ne sme da bude podloan uslovima sredine u kojoj se nalazi MIKROBIOLOKE ANALIZE VODE ZA PIE VODE I PRIRODNIH MINERALNIH VODA Mikrobioloki pregled vode za pie ima tri cilja: da utvrdi da li je voda zagaena fekalijama da utvrdi kako je stanje zatitnog vodonosnog sloja od spoljnog bakterijskog zagaenja da utvrdi efikasnost tehnolokog preiavanja vode (hlorisanja) Rutinska ispitivanja vode obuhvataju: odreivanje ukupnog broja bakterija u jednom mililitru i dokazivanje prisustva bakterija fekalnih indikatora u vodi Specijalna ispitivanja vode izvode se prema Pravilniku o higijenskoj ispravnosti vode za pie SL SRJ br. 42/98 i 44/99,

INDUSTRIJSKI ZNAAJ BIOFILMOVA Mikrobiolozi su tradicionalno bili fokusirani na slobodno-plivajue bakterije odgajane iz istih laboratorijskih kultura. Tek u skorije vreme prihvaeno je da u prirodi veina bakterija ivi sakupljena u biofilmove, u formi u kojoj je njihovo ponaanje u mnogome drugaije. Kao rezultat toga, biofilmovi su jedna od najsveijih tema u mikrobiologiji. Razumevanje bakterija u biofilmovima je izuzetno vaan korak u pripremi za budunost. Sposobnost bakterija da se prilagode okolini i da izbegnu svim naim naporima da ih eliminiemo, vredna je divljenja. U automatskim sistemima za snabdevanje vodom, 99% bakterija se, kao i u svim ostalim vodenim sistemima, nalazi u biofilmu na unutranjoj strani cevi. Ovi biofilmovi predstavljaju izvor najveeg broja slobodno-plivajuih bakterija u vodi za pie, od kojih neke mogu biti uzronici infekcija i zaraza kod ljudi i ivotinja. Jedna od najeih bakterija biofilma, Pseudomonas aeruginosa, spada u uslovno patogene bakterije koje mogu izazvati oboljenja kod osoba sa oslabljenim imunitetom. Pored toga to predstavljaju rezervoar bakterija opasnih po zdravlje, biofilmovi, takoe, mogu izazvati i koroziju vodovodnih cevi, ak i ako se radi o nerajuem eliku. Biofilmovi na raznim povrinama dovode do ogromnih materijalnih gubitaka u industriji, kroz razna oteenja opreme, koroziju cevovoda, gubitke energije, smanjenje prenosa toplote i hidraulikog pritiska u industrijskim sistemima za hlaenje, kontaminaciju proizvoda i razne infekcije. Tradicionalne metode unitavanja bakterija, kao to su korienje antibiotika ili dezinficijenasa esto su neefikasne protiv bakterija u biofilmu. Kako bi se unitile bakterije u biofilmu potrebne su ogromne doze ovih sredstava koje su, u tom sluaju, opasne po ivotnu sredinu, ili ak, po propisima za zatitu ivotne sredine, nedozvoljene. U ivoj sredini ove doze mogu biti ak i neprimenljive, jer one doze koje bi bile potrebne da unite bakterije u biofilmu, dovele bi i do smrti pacijenta. Zbog svega toga, neophodne su nove strategije koje se baziraju na boljem razumevanju procesa prianjanja, rasta i odvajanja bakterija od povrine. Nasuprot tome, poznavanje mikrobiolokih procesa na povrinama nudi mogunost za njihovo iskorienje u mnogim granama industrije i zatite ivotne sredine, kao to su bioremedijacija opasnog otpada, biofilteri za industrijsku vodu ili formiranje biobarijera za zatitu zemljita i povrinskih voda od kontaminacije. NASTANAK I RAZVOJ BIOFILMA Do poetka stvaranja biofilma dolazi im se nova cev napuni vodom. Razvoj biofilma se moe posmatrati kroz nekoliko osnovnih koraka: stvaranje povoljnih uslova na povrini adhezija bakterija-pionira formiranje sluzi ili glikokaliksa sekundarna kolonizacija biofilm sa svim funkcijama 1. Stvaranje povoljnih uslova na povrini Prvo to se nakuplja na povrini koja je u kontaktu sa vodom nisu mikroorganizmi, ve tragovi organskih materija koje se u vodi nalaze. Skoro istog momenta kada se povrina iste cevi nae u kontaktu sa vodom, na dodirnoj povrini cev-voda stvara se sloj organskog depozita. Ovaj sloj organskih materija na povrini cevi neutralie povrinsko naelektrisanje i slobodnu povrinsku energiju koji spreavaju bakterijsku eliju da prie dovoljno blizu zidu i ostvari inicijalno vezivanje. Dodatno, adsorbovani organski molekuli slue bakterijama kao izvor hrane. 2. Adhezija bakterija-pionira Neke od slobodno-plivajuih planktonskih bakterija u tekuoj vodi u cevi prilaze dovoljno blizu zidu cevi i ostaju u graninom sloju.Granini sloj predstavlja nepokretnu zonu u neposrednoj blizini zida cevi u kojoj brzina protoka pada na nulu.Neke od ovih bakterija se privremeno adsorbuju, a zatim budu desorbovane. Ovo predstavlja reverzibilnu adsorpciju. Inicijalno vezivanje se bazira na elektrostatikom privlaenju i fizikim silama, a ne na hemijskom vezivanju. Neke od adsorbovanih elija poinju da se pripremaju za dui

boravak na taj nain to formiraju strukture koje mogu trajno vezati eliju za povrinu. Ove elije postaju ireverzibilno adsorbovane. 3. Formiranje sluzi ili glikokaliksa Bakterije biofilma lue vanelijsku polimernu supstancu, ili lepljivi polimer koji odrava biofilm u celini i vezuje ga za zid cevi. Dodatna uloga sloja glikokaliksa je da hvata hranljive materije kojih ima malo u preienoj vodi, kao i da titi bakteriju od biocida. Prema Mittelman-u (1985. god.), vezivanje se ostvaruje vanelijskim polimernim materijama koje se izluuju iz elijskog zida bakterija i lie na strukturu paukove mree. Ovaj polimerni materijal sastoji se od naelektrisanih ili neutralnih polisaharidnih grupa koje, ne samo da ostvaruju vezivanje, ve slue i kao jonoizmenjivaki sistem za hvatanje i koncentrisanje tragova organskih materija iz okolne vode. Glikokaliks predstavlja i zatitni sloj vezanim elijama koji umanjuje efekte biocida i drugih toksinih supstanci. Kao posledica nakupljanja organskih materija, elije-pioniri poinju da se razmnoavaju. Kerke-elije zatim proizvode sopstveni glikokaliks poveavajui na taj nain jonoizmenjivaku povrinu. Ubrzo dolazi do formiranja nabujale kolonije bakterija. U zrelom biofilmu, 75-95% zapremine zauzima neureeni matriks glikokaliksa a samo 5-25% ine elije. Poto matriks glikokaliksa sadri velike koliine vode, povrina koja je prekrivena biofilmom postaje elatinozna i klizava. 4. Sekundarna kolonizacija Pored hranljivih materija, u mreu glikokaliksa hvataju se i elije mikroorganizama. Ovi sekundarni kolonizeri metabolizuju otpad primarnih kolonizera, a proizvode i svoje sopstvene otpadne materije, koje potom bivaju iskoriene od strane drugih elija. Prema Borenstein-u (1994.), kolonizacija od strane ovih drugih bakterija i plesni, koje slede pionirske vrste, pitanje je dana. 5. Biofilm sa svim funkcijama Zreo biofilm, sa svim svojim funkcijama, lii na ivo tkivo na povrini cevi. U pitanju je kompleksna, metaboliki kooperativna zajednica razliitih vrsta. Smatra se da u biofilmovima postoje i primitivni cirkulacioni sistemi. U lanku Slime City imaginarno je opisan zreo biofilm: Razliite vrste ive jedna uz drugu u sluzavim naseljima, pomaui jedna drugoj u iskoriavanju zaliha hrane i odupiranju antibioticima, to se ostvaruje kroz susedske interakcije. Toksini otpad proizveden od strane jedne vrste moe biti rado prihvaen kao hrana od strane druge susedne vrste. Nekoliko vrsta bakterija, udruenih u komunalni Slime City, od kojih je svaka snabdevena razliitim enzimima, u stanju su da razgrade zalihe hrane koje ni jedna vrsta sama ne bi bila u stanju da upotrebi. Biofilmovi su na svim nivoima proeti mreom kanala kroz koje putuju voda, smee, hranljive materije, enzimi, metaboliti i kiseonik. (Coghlan, 1996.) Postoje dva vida irenja biofilma: obina elijska deoba i povremeno otputanje bakterija-pionira koje mogu nizvodno naseliti neki drugi deo cevi. Vremenom dolazi do poveanja debljine biofilma, tako da njegova debljina poinje da prevazilazi debljinu laminarnog sloja i slojevi biofilma poinju prelaziti u slojeve sa veom brzinom tenosti i turbulentnim tokom. Zbog toga se deava da neke elije budu smaknute. Prema Mayette-u (1992.), ovim kasnijim pionirskim elijama je unekoliko olakano prianjanje na zidove, u odnosu na njihove uzvodne pretke jer roditeljski biofilm otputa organski otpad koji nizvodno formira inicijalni organski sloj na nekolonizovanim delovima cevi i ujedno predstavlja hranu za ostale elije. Prema Mittelman-u (1985.), za razvoj zrelog biofilma potrebno je nekoliko sati do nekoliko nedelja, u zavisnosti od sistema. Pseudomonas aeruginosa se esto sree kao bakterija-pionir i on je korien u mnogim istraivanjima biofilmova. U jednom eksperimentu naeno je da je elijama pseudomonade potrebno oko 30 sekundi da se adheruju na nerajui elik, ak i ako su u pitanju elektropolirane povrine. Roder Anderson i njegove kolege iz Centra za kontrolu bolesti u Atlanti izveli su ogled u kome su plastine cevi napunjene vodom koja je kontaminirana sa dve vrste roda Pseudomonas. Nakon inkubacije od osam nedelja cevi su ispranjene i napunjene hemikalijama sa dezinfekcionim svojstvima, ukljuujui hlor, i to je ostavljeno da stoji sedam dana. Nakon toga, cevi su ponovo napunjene sterilnom vodom i ista voda je periodino uzorkovana. Obe vrste pseudomonada su preivele u tretiranim cevima i ponovo uspostavile kolonije.

MEHANIZMI DELOVANJA BIOCIDA Antiseptici, dezinficijensi i konzervansi biocidi smatraju se neantibiotskim antibakterijskim sredstvima. Oni se esto klasifikuju kao grupa nespecifinih protoplazmatskih otrova, to u odreenom smislu i jesu. Antimikrobna aktivnost hemijskog sredstva dokazanog dejstva poinje njenim prodiranjem u eliju mikroorganizma. Sam put stizanja hemijskog sredstva do mesta delovanja u eliji zavisi od fiziko-hemijskih karakteristika hemijskog sredstva. Na antibiotsku aktivnost esto snaan uticaj ima afinitet biocidne strukture i molekulski sastav elijskog zida. Ciljnim dejstvom biocida smatraju se elijski zid, citoplazmatska membrana i citoplazma mikroorganizma. Biocidi deluju na elijski zid tako to ga razgrauju ili stvaraju neke nove ireverzibilne unakrsne veze sa nekom strukturom u njemu. Niske koncentracije odreenih dezinficijenasa deluju na enzime koji uestvuju u sintezi elijskog zida tako to ih usmeravaju na suprotnu reakciju razgradnju. Dejstvo na citoplazmatsku membranu moe se podeliti u tri kategorije: dejstvo na proteine membrane (inhibiraju aktivan transport kroz membranu) dejstvo na enzime membrane (inhibiraju enzime koji reguliu funkcionisanje membrane) dejstvo na membransku propustljivost (menjaju sastav membrane, a time i njenu permeabilnost) U citoplazmi postoji veliki broj znaajnih struktura na koje deluju biocidi: koagulacija citoplazme (biocid je koagulaciono sredstvo), ribozomi (razdvajaju ribozome na dva dela), nukleinske kiseline (pokreu autolitike procese u nukleinskim kiselinama), jedinjenja sa tio-grupom (oksiduju ili reaguju sa tiogrupama) i jedinjenja sa amino-grupom (reaguju sa amino grupama koje su neophodne za ivot elije). Razliiti tipovi mikroorganizama pokazuju razliite reakcije na biocidno dejstvo, to je prikazano u tabeli: Vrsta mikroorganizma Biocidna osetljivost ili rezistentnost Asporogene su najosetljivije, acidofilne bakterije su srednje osetljive, a spore su najotpornije. Gram-pozitivne bakterije (stafilokoke i streptokoke) generalno su osetljivije na biocide od gram-negativnih bakterija. Enterokoke su esto rezistentne na antibiotike, ali ne i neophodno osetljivije na biocide od streptokoka. Mikobakterije su rezistentnije od drugih asporogenih bakterija na irok spektar biocida. Fungalne spore mogu biti rezistentne Bez omotaa su vie rezistentni nego sa omotaem Kokcidije mogu biti visoko rezistentne Obino su visoko rezistentni

Bakterije

Gljivice Virusi Paraziti Prioni

BAKTERIJSKA REZISTENTNOST NA BIOCIDE Pod bakterijskom rezistentnou na biocide mogu se razmatrati dva tipa rezistencije: prava (prirodna, uroena) rezistentnost prirodna karakteristika organizma steena rezistentnost, ili hromozomska mutacija ili akvizicija plazmida ili premetanje Prirodna ili steena rezistentnost na biocide: Karakteristika Prirodna rezistentnost Prirodna karakteristika Posredno hromozomski, ali obino nije znaajno Steena rezistentnost Ostvaruje se mutacijama ili dobijanjem plazmida ili transposona (Tn) Plazmid/Tn-intermedijer, npr. ivin

Opte svojstvo Promenljivost biocida (enzimska inaktivacija)

Umanjeno dejstvo Prolazno

Primeeno kod nekoliko biocida Nije poznato

Manje bitno Katjonski biocidi i antbiotski rezistenti stafilokoka Moe doi do transfera plazmida u biofilmu Moe biti visoko u odreenim okolnostima

Proizvodnja biofilma Farmaceutski/kliniki znaaj

Fenotipska adaptacija Visoka

Kao to je ve reeno, stafilokoke i streptokoke su generalno osetljivije na biocide od gram-negativnih bakterija. Mikroorganizmi u bofilmu, koji su vezani za povrine, imaju sposobnost da se odupiru normalnim procesima dezinfekcije. Prema LeChevallier-u (1988. godine), bakterije biofilma pokazuju zadivljuu otpornost na biocide. Demonstracijom je dokazano da bakterije u biofilmu mogu biti 150-3000 puta otpornije na slobodni hlor i 2-100 puta otpornije na monohloramine, u odnosu na slobodno-plivajue bakterije. Prema Andersonu iz 1990.-e, Pseudomonas vrste imaju pametan nain odbrane, na taj nain to lui lepljivu sluz na unutranju povrinu cevi. Baktericidno sredstvo kojim se ispira sistem za distribuciju vode ubija samo slobodno-plivajue mikroorganizme, ali nije u stanju da dopre do bakterija uronjenih u lepljivi biofilm. Iz Borenstein-ovog istraivanja (1994. godine), bakterije esto proizvode vie egzopolimera nakon tretiranja biocidima nego pre tretmana, kako bi se zatitile. Naini na koje biofilm obezbeuje zatitu od dezinficijenasa: Zatitni omota Pre nego to dopre do bakterijske elije u biofilmu, sredstvo za dezinfekciju prvo mora da reaguje sa okolnom mreom polisaharida. Znai, nisu same elije u biofilmu otpornije na biocide od slobodnih elija, ve su one zatiene zatitnim omotaem. Na taj nain, oksidaciona snaga dezinficijensa bude istroena pre nego to on stigne do elije. Difuzijska ogranienja Kada je elija vezana za zid cevi, sposobnost prodiranja dezinficijensa je ograniena stepenom difuzije smee du graninog sloja i kroz sam biofilm. Potrebna je vea koncentracija i due kontaktno vreme da dezinfekciono sredstvo dospe do bakterijske elije u biofilmu u odnosu na slobodno-plivajue bakterije. Mehanizmi kojima se biofilmovi odupiru dejstvu antimikrobnih agenasa su: smanjenje koncentracije biocida u tenosti oko biofilma neuspeh biocida da prodre u biofilm prelazak bar jedne frakcije elija biofilma u stanje fizioloke otpornosti na biocid Po prvom scenariju, antimikrobno sredstvo biva istroeno do koncentracija koje su nedovoljne za unitavanje elija, pre nego to, uopte, dopre do biofilma. Po drugom scenariju, antimikrobno sredstvo dolazi do povrine biofilma, ali ne prelazi u dublje slojeve jer postoje ogranienja u transportu ovog sredstva u unutranjost biofilma. Do ovoga dolazi kada antimikrobno sredstvo reaguje sa povrinskim slojevima biofilma i neutralie se bre nego to je u stanju da prodire u biofilm. S druge strane, ukoliko antimikrobno sredstvo ne reaguje sa sastojcima biofilma, lako dolazi do penetracije u biofilm. Po treem scenariju, antimikrobno sredstvo prodire u biofilm, ali nije u stanju da uniti elije mikroorganizama, jer je dolo do promene fenotipa elija i pokazuju smanjenu osetljivost na biocide. Do promene fenotipa elija dolazi iz dva razloga: Uslovi smanjene koliine hranljivih materija dovode do stvaranja regiona u biofilmu koji su izuzetno siromani hranom. Mikroorganizmi u tim regionima prelaze u fazu usporenog rasta, ili se rast u potpunosti zaustavlja. Ovakve bakterije su manje podlone dejstvu biocida. Kod nekih elija u biofilmu se pojavljuje ''prekida'' koji aktivira promenu fenotipa nezavisno od ograniene koliine hranljivih materija.

Ova tri mehanizma odupiranja biocidima nisu uzajamno iskljuivi. Naprotiv, najvea verovatnoa je da e sva tri mehanizma otpora biofilma biti ukljuena u njegovo odupiranje dejstvu biocida. Do smanjenja osetljivosti biofilmova na biocide ne dolazi usled mutacija ili genetskih promena, kao to je sluaj pri stvaranju otpornosti na antibiotike. To se dokazuje time to vrste koje su veoma osetljive na odreeni biocid stiu izuzetnu otpornost kada se nalaze u biofilmu. Ali, kada iz biofilma ponovo preu u suspendovano stanje, ponovo postaju osetljivi na dati biocid. Iz svega navedenog sledi da biofilmovi ne slede ista pravila za dezinfekciju kao planktonske bakterije. Jedna od uoljivih razlika je da je stepen unitavanja elija biofilma uvek nii u odnosu na planktonske bakterije. Druga razlika je u tome to poveanje koncentracije hlora vie utie na stepen unitavanja elija u biofilmu, nego na planktonske bakterije. Slian rezultat dobijen je i za druga antimikrobna sredstva, kao to su glutaraldehid, i kvaternerne amonijumove soli. Praktino, iz ovog sledi da se biofilmovi bolje uklanjaju ukoliko se primeni relativno visoka koncentracija antimikrobnog sredstva. Ukratko, koncentrovanija doza je efektivnija nego produeno dejstvo pri niim koncentracijama. U sluaju tretmana vode za pie hlorom, naeno je da niske koncentracije hlora ak mogu dovesti do uveanja broja heterotrofa biofilma, kao to su koliformne bakterije. FAKTORI IZBORA DELOVANJA ANTIMIKROBNOG SREDSTVA Karakteristike hemijskog sredstva proces unitavanja ili inhibicije rasta mikroorganizama hemijskim sredstvom u osnovi je hemijska reakcija na iju brzinu i stepen delovanja imaju uticaj koncentracija hemikalija, temperatura, pH i formulacija, odnosno hemijski sastav. Mikrobioloke kontaminacije prisutne vrste mikroorganizama i stepen kontaminacije (bioburden) imaju znaajan efekat na rezultat antimikrobnog tretmana. Osetljivost mikroorganizama na hemijsko sredstvo se menja. Efikasnost antimikrobnog sredstva mora biti detaljno ispitana kako bi se osiguralo postizanje efekta koji je potreban za nameravanu upotrebu. Kako bi korisnici znali koji nivoa antimikrobske aktivnosti im je potreban u odreenoj situaciji, neophodno je kategorisati hemijska sredstva prema njihovoj antimikrobnoj aktivnosti. Nameravane upotrebe sredstva nameravana upotreba antimikrobnog sredstva, kao konzervansa, antiseptika ili dezinfekcijensa, imae uticaja na izbor hemijskog sredstva. Na primer: sastojci medicinskog preparata mogu neutralisati dejstvo konzervansa; za dezinfekcije instrumenata, hemijska sredstva ne smeju biti agresivna prema instrumentima, npr. ne smeju uzrokovati koroziju, menjati strukturu sintetskih polimera itd. Faktori sredine organska materija (krv, telesne tenosti, gnoj, mleko, ostaci hrane ili koloidni proteini) moe imati znaajne efekte na antimikrobni kapacitet, na adsorpciju ili hemijsku inaktivaciju, moe izazivati redukciju koncentracije aktivne supstance u rastvoru ili se ponaati kao prepreka prodoru dezinficijensa (osuene organske naslage). Toksinost jedinjenja pri izboru antimikrobnog sredstva za odreenu namenu mora se uzeti u obzir i njegova toksinost. HACCP POJAM, RAZVOJ, PREDNOSTI I MANE Akronim HACCP predstavlja skraenicu engleskih rei Hazard Analysis and Critical Control Point (Analiza opasnosti i kritine kontrolne take). HACCP se pojavljuje 60-ih godina prolog veka kao rezultat zajednikog razvoja kompanije Pillsbury, Armije SAD i NASA-e sa ciljem proizvodnje bezbedne hrane namenjene svemirskom programu (NASA je elela da ima program kako bi se garantovala bezbednost kosmonauta u pogledu hrane koju e konzumirati u svemiru). Javno je prezentovan 1971. god. na Amerikoj konferenciji o bezbednosti hrane. Od 1991. godine je preporuen od Komiteta Codex Alimentarius (FAO/WHO). Od 1995. godine je obavezna primena u EU. Od 1997. godine je u SAD obavezna primena u proizvodnji hrane ivotinjskog porekla.

HACCP bi se mogao nazvati konceptom ili sistemom obezbeenja proizvodnje zdravstveno bezbedne hrane. HACCP je metod za procenu opasnosti i uspostavljanja sistema kontrole, koji je u prvom redu fokusiran na preventivu, nego to se oslanja na ispitivanje gotovog proizvoda. Prednosti: poveava zdravstvenu bezbednost hrane (smanjenje potencijalnih bolesti, albi kupaca, gubitka poslovnog ugleda) vee fokusiranje na identifikaciju i prevenciju opasnosti od kontaminacije hrane omoguava efikasniji i efektivniji nadzora od strane inspekcije jasno definasana odgovornosti proizvoaa ili distributera za proizvodnju i promet bezbedne unapreenje meunarodne trgovine hrane HACCP je primenjiv kroz ceo lanac hrane od njive do trpeze. Svaki HACCP sistem je prilagodljiv promenama unapreenju opreme, tehnologije, razvoju... Primena HACCP-a je kompatibilna sa sistemima upravljanja kvalitetom, kao to su sistemi menadmenta kvalitetom po seriji ISO 9000. Mane: razvoj, implementacija i odravanje sistema zahtevaju dodatne resurse u pogledu vremena, strunosti i angaovanja osoblja, to u poetku poveava trokove subjekta koji se bavi hranom postoje potekoe sa primenom HACCP sistema u malim subjektima koji posluju hranom i/ili u onim koji proizvode veliki broj razliitih proizvoda HACCP je kako proces-specifian tako i proizvod-specifian, to ini praktino nemoguim da se direktno prenese sa jednog na drugog proizvoaa bez veih, znaajnijih i odgovarajuih modifikacija. FAZE IMPLEMENTACIJE HACCP-A (1-5) 1) FORMIRANJE TIMA iji je zadatak da razvije HACCP sistem u konkretnom preduzeu Potpuno razumevanje ciljeva primene HACCP sistema u preduzeu i dobijanje odgovarajue podrke od najvieg rukovodstva. Multidisciplinaran tim sa odgovarajuim specifinim znanjima i iskustima iz svih faza proizvodnje i prometa (najee 4-5 lanova). Kompetentnost lanova tima (sa znanjima iz oblasti sistema upravljanja kvalitetom i higijene hrane-mikrobiologija, dezinfekcija, deratizacija, hemija, mainski sektor...). Interni i eksterni deo tima, obuka lanova tima. Glavne odgovornosti rukovodstva subjekta koji posluje hranom su da: donosi i sprovodi strategiju i politiku za ostvarivanje bezbednosti hrane imenuje HACCP tim i odredi njegovog vou definie okvir, obim rada tima i rokove obezbedi resurse Glavni zadaci voe HACCP tima su da: vodi razvoj i uspostavljanje HACCP plana vodi evidenciju i dokumentaciju planira i organizuje validaciju i verifikaciju HACCP plana obavetava rukovodstvo o aktivnostima koje tim sprovodi

Glavni zadaci ostalih lanova HACCP tima su da: pomau razvoj i primenu HACCP plana; doprinose radu tima u skladu sa svojim znanjem, radnim odgovornostima i iskustvom, a naroito u oblastima identifikacije opasnosti i utvrivanju kontrolnih mera; redovno sprovode aktivnosti za koje su zadueni HACCP planom uestvuju u validaciji i verifikaciji HACCP plana 2) OPISIVANJE PROIZVODA Za svaki proizvod posebno (od znaaja za naknadnu identifikaciju opasnosti) naziv proizvoda sastav

Procena svih faktora koji utiu na bezbednost proizvoda: unutranji faktori pH, aw spoljanji faktori temperatura u procesu prerade, pakovanja, skladitenja pakovanje, rok upotrebe i uslovi skladitenja nain distribucije nain upotrebe sa aspekta zdravstvene bezbednosti Detaljan opis svih sirovina koje se koriste tokom proizvodnje: bioloke, fizike i hemijske, karakteristike, sastav, ukljuujui aditive i pomone materije, nain upotrebe poreklo nain proizvodnje, nain pakovanja i transporta nain skladitenja i rok upotrebe priprema i/ili tretman pre prerade kriterijume prihvatljivosti nabavljenih komponenti 3) PLANIRANA UPOTREBA PROIZVODA Pri kojim uslovima upotrebe namirnica nije opasna po zdravlje potroaa temperatura i vre,e uvanja. Identifikovati na koji nain krajnji potroa upotrebljava namirnicu (jesti bez naknadnog kuvanja, prokuvati pre upotrebe i sl.). Identifikacija grupa potroaka kojima je (ili nije) namenjen rizine grupe (alergine osobe, deca, dijabetiari...). 4) IZRADA DIJAGRAMA TOKA PROCESA Na najjednostavniji nain opisati i prikazati sve korake koji su ukljueni u proizvodnju, preradu i distribuciju proizvoda (ukljuene su i faze pripreme i skladitenja pojedinanih sastojaka proizvoda). Prikazuje: redosled i meuzavisnost aktivnosti ulaz sirovina, aditiva i pomonih materijala u proces ponovna obrada/prerada materijala otpremanje gotovih proizvoda, poluproizvoda i otpada Prilikom izrade dijagrama toka procesa, HACCP tim, kad je to potrebno i mogue, treba da naznai procesnu kategoriju u koju proizvod moe da se svrsta. To znai, da kod jednog subjekta mogu da postoje vie procesnih kategorija, od kojih svaka moe da ukljuuje vie proizvoda. Na primer, subjekti koji posluje hranom (naroito oni mali) mogu da proizvode vie razliitih proizvoda na istoj proizvodnoj liniji. Ako se ti proizvodi razlikuju samo u karakteristikama koje ne utiu na njihovu bezbednost (na primer, razlikuju se samo u koliini i vrsti zaina koji se dodaju), jasno je da spadaju u istu procesnu kategoriju. U tom sluaju, svi proizvodi iz jedne procesne

kategorije mogu da se ukljue u jedan HACCP plan.

Ovo olakava primenu HACCP sistema time to se omoguava jedinstvena kontrola razliitih proizvoda koji su svrstani u jednu procesnu grupu, korienjem jednog HACCP plana. Ukupno gledano, dozvoljeno je grupisanje u istu procesnu kategoriju samo onih proizvoda kod kojih su prisutne iste opasnosti koje mogu da utiu na njihovu bezbednost. Svaki korak u okviru proizvodnog procesa je potrebno opisati u formi standardne radne procedure/operacije (SOP).

5) VERIFIKACIJA DIJAGRAMA TOKA PROCESA Verifikacija verodostojnosti dijagrama toka na licu mesta. Potvrdu dijagrama toka mora raditi osoba ili osobe sa dovoljnim poznavanjem proizvodnog procesa. Sve korekcije moraju biti dokumentovane. PRINCIPI HACCP-A. PRINCIP 1 = Analiza opasnosti Nabrajanje svih potencijalnih opasnosti tokom proizvodnje i distribucije namirnica Izvriti analizu opasnosti (analizu teine tih opasnosti) Proceniti nivo rizika (verovatnoa pojave, mogue posledice, mogunost spreavanja) Definisanje mera za kontrolu identifikovanih opasnosti Kod identifikacije opasnosti treba imati u vidu uticaj prethodnog i narednog koraka: uticaj opreme, infrastrukturu, radnu okolinu, prethodne i naredne uesnike u lancu hrane. Odrediti prihvatljiv nivo zagaenja (u skladu sa vaeim propisima) da bi se ocenilo da li je neophodna posebna mera za spreavanje, elimimaciju ili smanjenje opasnosti po zdravstvenu bezbednost proizvoda. Metodologija mora biti dokumentovana i rezultati ocene moraju biti zapisani. Preventivne aktivnosti: izbor takvih aktivnosti, metoda i sredstava koje e onemoguiti pojavu opasnosti ili e verovatnou njihovog pojavljivanja svesti na minimalnu meru. Moe se desiti da za kontrolu neke odreene opasnosti potrebno preduzeti vie razliitih kontrolnih mera, ali ponekad jedna kontrolna mera moe da bude pogodna za kontrolu vie opasnosti. PRINCIP 2 = Identifikacija CCP Kritina kontrolna taka (CCP) je korak (taka/postupak/operacija) u kome se moe uticati na opasnost kako bi se spreio ili eliminisao rizik po bezbednost hrane ili redukovao na prihvatljiv nivo. Broj CCP zavisi od vrste proizvoda i konkretnog tehnolokog procesa. Na nekim od CCP se uz stalnu kontrolu opasnost moe eliminisati, dok se na drugim potencijalne opasnosti mogu samo ublaiti. Primeri najeih CCP: pasterizacija kuvanje suenje dozairanje hemijskih sredstava korekcija pH kontrola ambalae pranje i dezinfekcija PRINCIP 3 = Odreivanje kritinih graninih vrednosti Kritine granine vrednosti su vrednosti karakteristine veliine koje se ne smeju prei ukoliko se eli postii bezbednost proizvoda. Kao granine vrednosti se definiu neke fizike, hemijske ili bioloke veliine. PRINCIP 4 Uspostavljenje nadzora CCP Nadzor je planirano merenje ili promatranje CCP o odnosu na kritine granine vrednosti. Omoguuje otkrivanje gubitka nad CCP. Gde god je mogue, poeljno je primeniti on-line metod (kontinuirano) jer omoguava nadzor u realnom vremenu. Ako nadzor nije kontinuiran obim i uestalost nadzora mora garantovati kontrolu nad CCP. Fizika i hemijska merenja su pogodnija od mikrobiolokih jer mogu biti bre izvedena. PRINCIP 5 Odreivanje korektivnih mera za sluaj prekoraenja kritinih graninih vrednosti Korektivne mere su definisane i propisane za svaku CCP i odgovornost sprovoenja. Aktivnosti koje se preduzimaju kada nadzor nad CCP ukazuje na odstupanja od krit. gran. vred. Definie: ta uraditi sa proizvodom (vraanje u proces, unitavanje, promena namene) ustanoviti uzrok neusaglaenosti mere za vraanje procesa pod kontrolu spreavanje ponavljanja neusaglaenosti

PRINCIP 6 Verifikacija HACCP sistema Uspostavljanje postupaka verifikacije provere delotvornosti HACCP sistema. Uestalost verifikacije treba biti dovoljna da potvrdi da li je sistem delotvoran. Verifikaciju obavljaju osobe koje su nezavisne od zaduenja za nadzor i korektivne akcije. Kada nije mogue sprovesti je interno onda to u ime organizacije ine spoljni strunjaci ili kvalifikovana trea lica. Gde je mogue validacija aktivnosti treba da ukljui odgovarajue mere u cilju potvrivanja delotvornosti svih elemenata HACCP sistema. Verifikacione aktivnosti: preispitivanje HACCP sistema i plana i njihovih zapisa preispitivanja odstupanja i neusaglaenih proizvoda potvrivanje da li su CCP pod kontrolom PRINCIP 7 Dokumentovanje sistema Kvalitetno i tano voenje zapisa je neophodno za delotvornost HACCP sistema. Dokumentacija se po potrebi predstavlja potroaima ili kontrolnim organima. Dokumentacija sadri: spisak tima za razvoj HACCP sa definisanim odgovornostima opis proizvoda verifikovani dijagram toka opasnosti koje postoje u vezi sa svakom CCP i odgovarajue preventivne mere kritine granine vrednosti planovi korektivnih mera procedure za voenje zapisa procedure za verifikaciju HACCP sistema

Marina Rajic