Practica N4

DETERMINACIN DE BACTERIAS AEROBIOS MESFILOS VIABLES I. Introduccin:

El anlisis de los alimentos est catalogado por diversas tcnicas y mtodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean slidos como las carnes, verduras y frutas, o lquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos mtodos tenemos la numeracin de microorganismos aerobios mesfilos, la cual nos permite determinar cuntos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Segn la norma tcnica Peruana para la leche cruda (NTP 202.086:2001) y la norma
tcnica Peruana para jugos de frutas (NTP 203.002:1979) establecen que el numero de microorganismos aerobios mesfilos y facultativos deben ser hasta un mximo de 1000000 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la poblacin. Por otro lado las tcnicas para poder encontrar la numeracin de aerobios mesfilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como

clculo estadstico del nmero de clulas viables. El recuento total de bacterias en placa es un mtodo til para obtener una idea del grado de frescura o pronta alteracin de los alimentos, dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. La mayora de los alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patgenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolpticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973) La presencia de microorganismos aerobios mesfilos en los alimentos puede ser relacionada directamente con la manipulacin, el estado de frescura o de descomposicin del producto y la temperatura de conservacin del producto. Un nmero relativamente bajo de estas bacterias no es sinnimo de buena calidad bacteriolgica del alimento, ya que puede contener microorganismos que producen enterotoxinas o son patgenos. (Venegas y col., 1990).

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La aplicacin de este mtodo se basa fundamentalmente en que, si el recuento es efectuado luego de un profundo conocimiento de la manipulacin antes del muestreo (temperatura, empaque y otros), puede proporcionar una medida comparativa del grado general de contaminacin bacteriana e higiene aplicada (FAO, 1998). En el grupo de los mesfilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminacin de la materia prima. Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin. La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos. La inmediata alteracin del producto. El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

II.

Objetivos:
Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos que contiene un alimento Familiarizarse con mtodos directos para la obtencin de microorganismos utilizando el mtodo de recuento de colonias en placa. Determinar si el producto alimenticio que se analiza est en condiciones aptas para el consumo humano. Determinar cuntos microorganismos presenta la muestra que analizamos.

III.

Materiales:
Material Biolgico muestra lquida: Microbiologa de los Alimento I

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Jugo de Soya.

Material de laboratorio: Medio de cultivo: Agar Plate Count Diluyente: Agua peptonada 0.1 %

Pipetas: (1ml y 10 ml). Micropipeta. 11 Placas Petri. Ansa calibrada Mechero. Balanza. Estufa (29 - 31 C). Tubo de dilucin. Esptula de Drigalsky

IV.

Procedimiento:
a) Preparacin de la muestra: i) Si es muestra liquida se deber guardar en refrigeracin antes de el anlisis correspondiente, para disminuir el metabolismos bacteriano. Y se deber medir en mililitros. ii) Si a muestra es solida o semislida y est congelada, debemos esperar a que se descongele a medio ambiente. iii) Si la muestra solida o semislida se encuentra a T ambiente, se proceder con el anlisis. iv) Para diluir las muestras solidas es necesario licuarlas, tal es el caso de las verduras. Y luego se pesara.

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v) Las diluciones se debern preparar de la siguiente manera: Para muestras liquidas: De la muestra madre sacar 3 ml y diluirlos en 27 ml de agua Peptonada. Luego pasar un 1 ml a cada tubo con 9 ml de agua Peptonada, hacer progresivamente hasta llegar a la dilucin 10
-6.

b) Tcnicas empleadas: i) Mtodo de placa vertida - Profundidad: Primero se diluye la muestra a analizar. Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en dos placas por dilucin. Despus de esto rpidamente agregamos el Agar Plate Caunt, homogenizamos con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de derecha izquierda. Para fines de la prctica solo trabajaremos con la dilucin 10 que solo utilizaremos 6 placas.
-3.

Por lo

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1mL

1mL

9 ml DAP

9 ml DAP

10-2 10-1
1mL 3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%

10-3
1mL

A 10-1

B 10-1

A 10-2

B 10-2

A 10-3

B 10-3

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Procedimiento del mtodo a Profundidad

3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%

Agregamos el Agar Plate Count, sobre el mililitro y homogenizamos

Placas con Agar Plate Count, con las diluciones de 10-1 has 10 a la10-6.

A 10-1

B 10-1

A 10-2

B 10-2

A 10-3

B 10-3

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ii) Mtodo de Superficie: De la dilucin 10-, sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6. Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre la superficie. Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con la esptula de Drigalsky. Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilucin 10-3 y con tan solo 1 placa por dilucin

9 ml DAP

9 ml DAP

10-2 10-1
1mL 3 ml de jugo de soya + 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%

10-3
1mL

Se extiende el mililitro sobre la superficie de la placa con la esptula de Drigalsky

B 10-2 A 10-1 C 10-3

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Procedimiento del mtodo a Profundidad
Hasta la dilucin 10--3

De la dilucin 10- sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente

Del tubo con la dilucin 10--2 sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente

Agregamos 1ml de cada dilucin a sus respectivas placas coma Agar plate count.

Dilucin 10--3

Con la esptula de Drigalsky extendemos la muestra sobre toda la superficie de la placa A 10

-1

B 10-2

C 10-3

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iii) Mtodo de Goteo: Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de gota sobre un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este procesdimiento se realiza dos veces en la misma placa en lados opuestos. Para fines del curso solo otilizaremos las soluciones 10-2 y 10-3.

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V. Resultados:

CONTEO x TIEMPO MTODO Total 24 H Promedio Total 48 H Promedio

En Profundidad 10-1 A 10 B 10-2 A 10 B 10-3 A 10 B

-3 -2 -1

Incontable -----Incontable Incontable -----Incontable 154 140 138 105 146 135 123

Incontable -----Incontable Incontable -----Incontable 198 220 170 165 184 189 193

Por Goteo 10-2 10-3 160 140 160 140 Por superficie 10-1 10
-2

198 188

198 188

Incontable ---------Incontable 111 118 115

Incontable ---------Incontable 143 150 147

10-3

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De los resultados obtenidos se interpret de la siguiente. manera: Para el mtodo de conteo por profundidad: Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en la dilucion10-3, de las diluciones se sac el promedio por horas y cuadrantes. En la dilucin 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 135 colonias y a las 48 h. 189 colonias.
Ufc/gr de muestra Ufc/gr de muestra = = N de colonias 189 x x Factor de dilucin 103 = 19 x 104 ufc/gr

El recuento de bacterias aerobias mesfilas viables es igual de 19 x 104ufc/gr en la muestra liquida de jugo de soya. Para el mtodo de conteo por Goteo. Se realizo el conteo en las dos diluciones 10-2 y 10-3, de los cuales se obtuvo el promedio por horas. En la dilucin 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 160 colonias y a las 48h. 198 colonias. En la dilucin 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 140 colonias y a las 48 h. 188 colonias. Para que los resultados de las diluciones estn bien la dilucin menor debe contener a la mayor en 2 veces, as que dividimos:
A las 24 h. 160 10-2 -3 10 140 A las 48 h. 10-2 198 -3 10 188

1.15

1.05

La solucin ms cercana a 2 es la de 24h, y se tomara la dilucin ms alta (10-2 ). Entonces el nmero de UfC/ ml de muestra es: 160 x 10-2 = 16 x 10-3. ufc/ml

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Por lo tanto el nmero de M.O aerobios mesfilos viables de jugo de soya es: 16 x 10-3.ufc/ml. Para el mtodo de Superficie: En este mtodo se obtuvo que a las 24 horas se contaron un promedio de 115 colonias y a las 48 h un promedio de 147. El promedio de ambos conteos es de 131. Entonces el numero de UFC/ml de muestra es 13 x 10- . ufc/ml. Por lo tanto el nmero de microorganismos aerobios mesfilos obtenidos por este mtodo equivale a 13 x 10- . ufc/ml de muestra de jugo de soya adquirida en el Mercado Modelo de Chiclayo.
4 4

VI.

Conclusiones:
a. Qu otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los anlisis microbiolgicos en alimentos? Adems del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy comn el uso del Diluyente Agua de Triptona (Tryptone Water: TW) y la Solucin Tinger , cuyas composiciones son las siguientes:

VII. Cuestionario:

Tryptone Water Triptona Cloruro de sodio Agua destilada 1 000 mL 10 g 5g

Solucin Tnger Cloruro sdico Cloruro clcico anhidro Hidrgeno carbonato sdico Agua destilada 1 000 mL 0.20 g 9g 0.42 g Peptona

BPW 10 g 5g

Cloruro sdico

Fosfato sdico

9g

Fosfato potsico Agua destilada 1

1.5 g 000 mL

Tambin se podra usar el Solucin Salina Fisiolgica (SSF) como diluyente, esta solo contiene 0.900 g de cloruro de sodio para 100 mL de agua destilada. Microbiologa de los Alimento I

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b. Por cunto tiempo y a cuntas revoluciones por minuto se debe tratar una muestra slida para ser homogenizada? Para tratar una muestra slida hay que licuarla o triturarla en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos. c. Cules son las ventajas y desventajas de los tres mtodos usados? Ventajas: Se obtienen resultados rpidos de un da para otro. Hace un recuento total que incluye todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas, adems refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin y las condiciones higinicas de la materia prima. Se puede aplicar para productos slidos como carnes, verduras, mariscos. Desventajas solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas, adems se estima la microflora total sin especificar los tipos de microorganismos y por ltimo, si tener un recuento bajo de aerobios mesfilos eso no nos asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. No diferencia microorganismos patgenos de la flora comn. El procedimiento est sujeto a error.

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