BYOKMYA I 4.

Peptidler

F. Zihniolu

Peptidler
Amino acid Polipeptid Protein

Aminoasitlerin birinin -karboksil grubu ile dier aminoasidin -amino grubu arasnda 1 mol su ayrlmasyla oluan kovalent baa peptid ba denir. Bu ba amid ba karakterindedir.
Karboksil Amino grubu grubu

Peptid Ba

AA1

AA2

Dipeptid

Peptidler

Peptidler yapsna giren aminoasit saylarna gre;

2 aminoasit : dipeptid 3 aminoasit : tripeptid 4 aminoasit : tetrapeptid 5 aminoasit : pentapeptid <10 aminoasit : Oligopeptid <100 aminoasit : Polipeptid >100 aminoasit : Proteinler

Peptidlerde adlandrma yaplrken karboksil grubu reaksiyona katlan aminoasidin adna il taks eklenir.
serin-glisin-tirozin-alanin-Lsin N-ucu; Serin, C-Ucu; Lsin 4 peptid ba 5 AA; penta peptid Serilglisiltirozilalanillsin 3 Harfli ksaltma N - terminal C - terminal Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu Tek Harfli ksaltma SGYAL

Alanilglisin
+ H3N N-terminal H C CH3 O C N H H C H O C O C-terminal

AlaGly AG

Alanilglisin ve Glisilalanin yapsal izomerlerdir.

H C CH3 H C H O C N H O C N H H C H H C CH3 O C O O C O Alanilglisin AlaGly AG

+ H3N

+ H3N

Glisilalanin GlyAla GA

Peptid Ba ve Yaps

40% ift ba karakteri Rezonans formlleri Ksa ba uzunluu

Yaklak 0.133 nm uzunluunda tipik tek badan daha ksa ancak ift badan uzun

ift ba rotasyona engel olur.

ift ba karakterine bal olarak peptid bandaki 6 atom her zaman planar(dzlemsel) yapdadr.

Peptid Ba ve Yaps
Peptid ba ; protein yaps ve fonksiyonunda etkin rol oynar. Temel zellikler:
1. 2. 3. 4. Planar(dzlemsel) Ksmi ift ba karakterine bal olarak; rijit Hemen hemen her zaman trans konfigrasyonda Polar. En az 2 hidrojen ba oluturabilir.

Peptid Bann Planar Yaps (Amid Dzlemi)

Peptid Grubundaki 6 atom tek bir dzlemde yer alr!

Amid azotu ile karbonil oksijeni arasndaki rezonans nedeni ile peptid ba planar ve sabittir.

Peptid Ba Rezonans Formlleri

C=O arasndaki ift ba C-N bann rotasyonunu salar

C=N arasndaki ift ba C-N bann rotasyonunu engeller, ancak O ve N zerinde ykler oluur.

Doru elektron younluunun bulunduu ararn. C-N ba rotasyonu iin gerekli enerji bariyeri(88kJ/mol) amid grubunu planar tutmak iin yeterli

Peptid iskeleti ba rotasyonlarndaki limitasyonlar nedeni ile rijittir.

Peptid Ba Uzunluklar

Ba Alar ve Uzunluklar

Peptid Ba, , ve alar

Peptid ba planar ve sabit Sadece alfa karbona bal balar etrafnda rotasyon mmkmdr.

(omega)

Phi, : N-C banda rotasyon, +180 den -180. Psi, : C - C banda rotasyon, +180 den -180. Omega, : peptid banda rotasyon, C1-{C-N}- C2

 as planardr (0 - cis, veya 180 - trans) ve esnektir, rotasyon bu balarda oluur Ancak, bir amino asit art iin ve sterik engeller ile limitlidir.

Amid Dzlemlerinin Rotasyonu

Eer (,) tm artklar iin biliniyor ise, peptidin iskelet yaps da biliniyor demektir. Pozitif (,) deerleri C dan bakldnda saat ynnde rotasyonu ifade eder.

Yasaklanm Yaplar(sterik engelleme)

(,)=(0,180), iki karbonil oksijeni birbirine ok yakn (,)=(180,0), iki amid grubu akr; (,)=(0,0), karbonil oksijeni amid grubu ile akr.

Mmkn olan iki konfigrasyon vardr, her ikisi de planardr.

Trans istemli konfigrasyon; zellikle byk R gruplar ile Cis ounlukla PRO artklar, ancak trans form 4:1 daha istemli

Peptid konformasyonlar

Trans peptid grubu

Cis peptid grubu

Prolin izomerleri

Prolin, izleyen amino asit artna gre trans veya cis polipeptid formu oluturabilir. Be yeli halka yapsnn varl, asnn(N ve C arasndaki a) yaklak olarak -65o dir.

Ba rotasyonu; protein katlanmas ve 3 boyutlu yap iin nemlidir.

Ramachandran Diyagramlar
Phi ve psi alarnn mmkn olan tm kombinasyonlarn ierir. Baz alar proteinlerin spesifik sekonder yaplarnn tayini iin tanmlaycdr. (phi) ye kar (psi) diyagramlar

Ramachandran Plot

Beyaz = sterike izin verilmeyen konformasyonlar

(atomlar van der Waals yaraplar toplamndan daha fazla birbirlerine yaklarlar)

Mavi = sterike izin verilen konformasyonlar

Peptidlerin Titrasyon Erisi ve zoelektrik Nokta

Peptidlerin de serbest aminoasitler gibi karakteristik bir titrasyon erisi ve izoelektrik noktas mevcuttur. rnein; GluGlyAlaLys tetrapeptidinde ok asidik pHda pKa nn altnda tm iyonize olan gruplar protonlanm formda bulunur ve net yk +2 dir. Bundan sonra NaOH ile titre edilir ve protonlar uzaklatrlrsa farkl gruplara pH deerine gre pKa deerlerinin zerinde protonlarn kaybederler. Net ykn 0 olduu pH, izoelektrik noktadr.

Bir tetrapeptid; Glu-Gly-Ala-Lys N-terminal: Glu, C-terminal: Lys aminoasitleri 3 peptid ba GlutamilGlisilAlanilLizin

Bir tetrapeptidin poliamfolitik davran

PEPTD YAPI ANALZ

Aminoasit bileenlerinin tayini Aminoasit dizi analizi Polipeptid zincirinin yaps R-gruplarnn pozisyonlar oklu peptid zincirlerin varl Protein olmayan bileenlerin belirlenmesi

Aminoasit Bileenlerinin Tayini

Genelde asit hidrolizi; 6 N HCl ile 110oC de azot altnda 24 saatte aminoasitlerine hidrolizlenirler. Aminoasit karm; a) Klasik aminoasit analizr b) HPLC yada c) Gaz-sv kromatografisi ile analizi yaplr.

Doal Yapnn Bozundurulmas

a) Non-kovalent balarn paralanmas (pH, scaklk, kimyasal modifikasyon, denaturantlar (re, GdnHCl, SDS) b) Kovalent balarn paralanmas; dislfit balarn paralanmas (zincir ii veya zincirleraras) (performik asit oksidasyonu veya merkaptoetanol ile indirgeme)

Peptid Hidrolizi ve Fragmantasyon

Peptidlerin hidrolizi eitli yollarla olur:
1) Asit veya baz hidrolizi: Tm peptid balarnn hidrolizi, rn:6 N HCl, 110 oC veya ksmi hidroliz 2) Enzimatik; proteolitik enzimler(proteazlar) 3) Kimyasal; Spesifik peptid balarnn CNBr ile paralanmas rn: Metnin C-ucundan hidrolizi

Baz proteolitik enzimlerin dizi spesifiklii

CNBr Reaksiyonu

N-terminal belirlenmesi
1) Sanger metodu(2,4-DNFB) 2) Edman degradasyonu(PITC) 3) Dansil metodu(Dansyl-Cl) 4) EnzimatikYnt.(aminopeptidaz)

C-terminal belirlenmesi
1)Hidrazinoliz (Hidrazin ile par.) 2) LiBH4 ile indirgeme 3) Enzimatik(Karboksipeptidaz)

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu

Frederick Sanger tarafndan gelitirilmitir. nsulin dizisinin belirlenmesi iin kullanlmtr. (6 kDa protein) 12 yl bu metod ile uram 1958 ylnda Nobel dl

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu

Sanger metodundaki anahtar reaktif; 1-fluro-2,4-dinitrobenzen Sanger Reaktifi nukleofilik aromatik substitsyon
NO2 O2N F

Sanger Metodu(devam)
1-Floro-2,4-dinitrobenzen N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.
NO2 O2N O F + H2NCHC O NHCHC O NHCH2C O NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

- HF
NO2 O2N O NHCHC O NHCHC O NHCH2C O NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

Sanger Metodu(devam)
Kuvvetli Asit(HF) hidrolizi ile tm peptid balar paralanarak amino asit karm oluur. Bu karmda sadece N-terminalde yer alan amino asit 2,4-DNP amino asit trevidir.
NO2 O2N O
+

NHCHCOH + H3NCHCO + H3NCH2CO + H3NCHCO CH(CH3)2

2,4-DNP Valin

O
+

CH2C6H5
H3O+

CH3

NO2 O2N

O NHCHC

O NHCHC

O NHCH2C

O NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

N-terminal belirlenmesi Edman Metodu

Edman Degradasyonu ve Peptidlerin Otomatik Dizi Analizleri

Edman Metodu(Degradasyonu)
peptid peptid aretleme aretleme (PITC) (PITC) Paralama Paralama
Dzenlenme adm Balanma adm

Dier dng Dier dng

Edman Degradasyonu (devam)

1. N-terminal amino asit tayin yntemi 2. Sral olarak yaplabildii iin, ayn rnek zerinde dizi analizlenebilir. Genelde Nterminalden balyarak 20 AA(20 dng) bu metod ile belirlenebilir. 3. 10-10 g rnek yeterlidir. 4. Otomatize edilebilir.

Edman Degradasyonu (devam)

Edman degradasyonundaki anahtar reaktif; fenil izotiyosiyanat (PITC)

Edman Degradasyonu (devam)

Fenil izotiyosiyanat N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer. O + peptid C6H5N C S + H3NCHC NH R S O NH peptid

C6H5NHCNHCHC

R feniltiyokarbamoil trevi (PTC)

Edman Degradasyonu (devam)

PTC trevleri daha sonra TFA(susuz ortam) ile muammele edilerek N-terminal AA peptidden ayrlr.

O peptid

C6H5NHCNHCHC NH R TFA C6H5NH C N

tiyazolon

C CH R

O +

+ H3N

peptid

Edman Degradasyonu (devam)

C6H5 S N C HN C CH R S C6H5NH C N C CH R O + O
Tiyazolon oluum koullarnda, tiyazolon tekrar dzenlenerek N-terminal amino asitin feniltiyohidantoin (PTH) trevi oluur.

+ H3N

peptid

Edman Degradasyonu (devam)

C6H5 S N C HN C CH R
PTH- Amino asit trevi

PTH AA trevi izole edilir ve tanmlanr. O Zarar grmeden kalan peptid(1 AA eksik), tekrar Edman degradasyonuna tabi tutulur.(2.,3.,dng vb.)

Dansil Metodu ile N-terminal Analizi

Bir ok peptidde N-terminal, N-formil veya N-asetil gruplar ile bloke edilmi formda bulunurken C-terminal ise amidlere modifiye olmutur.

N-Formil grubu

N-Asetil grubu

C terminal amidi

Peptid Sentezi
Amino asitler arasnda peptid ba oluturmak zor deildir. Esas nemli olan amino asitleri doru dizide birletirmek rn: fenilalanin ve glisin karmnda geliigzel peptid ba oluumu 4 tane dipeptid oluumu ile sonlanr. PhePhe, GlyGly, PheGly, GlyPhe

Peptid Sentezi
1. Olaslk saysn snrlamak iin bir amino asitin amino azotu ile dier amino asitin karboksil grubunu koruma altna almak gerekir. N-Korunmu fenilalanin O X NHCHCOH CH2C6H5 C-Korunmu glisin O H2NCH2C Y

Peptid Sentezi
2. ki korunmu amino asidin balanmas O O X NHCHCOH CH2C6H5 O X NHCHC O NHCH2C Y H2NCH2C Y

CH2C6H5

Peptid Sentezi
3. N-terminaldeki amino grubu ve C-terminaldeki karboksil grubu korumasnn kaldrlmas O X NHCHC O NHCH2C Y

CH2C6H5 O O

+ H3NCHC

NHCH2CO

CH2C6H5

Phe-Gly

Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunmas

Amino Gruplarnn Amid Formunda Korunmas * Amino gruplar amidlere dntrlerek korunabilirler. * Benziloksikarbonil (C6H5CH2OCO) yaygn olarak kullanlan koruyucu gruptur ve Z ksaltmas ile ifade edilir. * Z-korumas amino asidin benziloksikarbonil klorr ile muammele edilmesi ile gerekletirilir.

Amino Gruplarnn Amid Formunda Korunmas

O CH2OCCl
benziloksikarbonil klorr(Z)

+ H3NCHCO CH2C6H5
1. NaOH, H2O 2. H+

Phe

O CH2OC

O NHCHCOH CH2C6H5 (82-87%)

Amino Gruplarnn Amid Formunda Korunmas

O CH2OC O NHCHCOH CH2C6H5 Ksaltma: O veya Z-Phe

ZNHCHCOH CH2C6H5

Z- Korumasnn kaldrlmas
Benziloksikarbonil koruyucu grubunun en byk avantaj kolayca uzaklatrlabilmesidir. a) hidrojenoliz b) HBr(asetik asitte) ile paralama

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklatrlmas: Hidrojenoliz

O CH2OC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 H2, Pd O CH3 CO2 H2NCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 (100%)

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklatrlmas: HBr ile Paralama

O CH2OC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 HBr O

CH2Br

CO2

+ H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 Br CH2C6H5 (82%)

Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunmas

tert-Butoksikarbonil Koruyucu Grup O (CH3)3COC O NHCHCOH CH2C6H5 Ksaltma: O BocNHCHCOH CH2C6H5 veya Boc-Phe

Boc-Koruyucu Grubunun Uzaklatrlmas: HBr ile Paralama

O (CH3)3COC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 HBr H3C C H3C CH2 CO2 O

+ H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 Br CH2C6H5 (86%)

Peptid Sentezi: Karboksil Grubunun Korunmas Karboksil Gruplarnn Ester Formunda Korunmas Karboksil gruplar genelde ester formunda korunur. Metil ve etil esterlerinden korumann kaldrlmas bazik ortamda hidroliz ile gerekletirilir. Benzil esterler hidrojenoliz ile paralanrlar.

Benzil Esterlerinin Hidrojenolizi

O C6H5CH2OC O O NHCHCNHCH2COCH2C6H5 CH2C6H5 H2, Pd + H3NCHCNHCH2CO CH2C6H5 (87%) O

C6H5CH3 CO2

CH3C6H5

Kat-Faz Peptid Sentezi: Merrifield Metodu

Kat(solid) faz sentezinde balang materyali inert kat bir destek materyaline balanr. Reaktantlar zeltiye eklenir. Reaksiyon; kat ve solsyon arasndaki arayzede gerekleir. Balang materyali kat destek zerine bal olduundan oluan her rn de kat destek materyaline bal olarak kalr. Saflatrma; kat destek materyalinden basit bir ykama ile yan rnlerin uzaklatrlmas ile gerekleir.

Kat Destek Materyali

CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

Stiren ve divinilbenzen kopolimeri Yukarda polstiren gsterilmitir, divinilbenzen ile apraz balama ile daha rijit bir polimer elde edilmektedir. Polimerik destein klorometilmetil eter ve SnCl4 ile muammele edilmesi ile benzen halkalarnda ClCH2 yan zincirlerinin olumasn salar.

Kat Destek Materyali

CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

CH2Cl Klorometil grubu bir benzil halojenrdr ve nukleofilik sbstitsyona reaktiftir(SN2). Klorometillenmi destek materyaline Boc-korumal C-terminal amino asit ilave edilir, nkleofilik sbtitsyon oluur ve Boc-korumal amino asit reineye ester olarak balanr.

Merrifield Yntemi
O

BocNHCHCO R

Daha sonra Boc koruyucu grup HCl ile uzaklatrlr.

Merrifield Yntemi
Amino grubunun aktivasyonu (DCC) O sonras ikinci amino asidin BocNHCHCO balanmas R2

Boc koruyucu grubun uzaklatrlmas

Bir sonraki amino asidin eklenmesi ve dngnn tekrarlanmas

Merrifield Yntemi

Sentezlenen peptidin kat destek materyalinden ayrlmas (CF3CO2H de hazrlanm HBr)

Merrifield Yntemi
Merrifield yntemi otomasyona uygun Bir nanopeptid (bradykinin),1962 ylnda, 8 gnde 68% verim ile sentezlenmitir. Ribonukleaz (124 amino asit), 1969
369 reaksiyon; 11,391 adm

Kimyada Nobel dl: 1984

Fizyolojik neme Sahip Kk Peptidler