VII.

APLICACIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS EN LAS DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1. Para comprender los principios y las ventajas de la suplementacin de enzimas, es necesario observar estrechamente los factores envueltos: el substrato, los tipos y acciones de las enzimas y las propiedades que dar este agregado enzimtico a los productos finales (3, 52). Debido a que la estructura espacial de la protena participante de las enzimas (por ej., Helicoidal o globular) es muy sensible frente a las condiciones ambientales (temperatura, aire y agentes qumicos), las enzimas son bastante lbiles, debiendo conservarse secas, en envases cerrados y a baja temperatura, si se almacenan por mucho tiempo. Sus soluciones deben ser recientes y se preparan en tampones apropiados con adicin de adecuados reactivos de proteccin. 2. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA MOLINERA Y PANADERA 2.1. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, pues acta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina acta en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que acta sobre el terminal de la

molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). La beta-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivndose a 70C por 15 min. El pH ptimo de la beta-amilasa es de 4,5. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estn presentes en la masa, y cuya formacin depende, a su vez, de la accin sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adicin de extracto de malta usado tambin para este objeto. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adicin. La alfa-amilasa de origen fngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitacin y una aereacin intensas), aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as la maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las siguientes ventajas: - mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa; - aceleracin de la fermentacin; - desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido; - aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad ms fina y de costra ms uniforme y ms coloreada. La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se han sealado anteriormente. 2.2. PROTEASAS. Origen: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (Bacillus, Streptococcus) y vegetal (Canica papaya L: Papana). Accin. Desdoblamiento hidroltico de protenas y pptidos hasta aminocidos. Aplicaciones: Como la adicin de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes de la masa, la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo duro, ricas en gluten (como las de Canad y Rusia), mientras que en harinas pobres o medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa. En los casos en que la adicin de proteasa es conveniente, se produce una mayor extensibilidad y elasticidad de la masa, acortndose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecnico (maquinofilia). El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retencin de gas, mejorando su textura y simetra, como tambin sus condiciones de conservacin y aun de aroma (40); esto ltimo, sobre todo si se asocia a una adicin de amilasa.

Como la protelisis en la masa puede ser inhibida por la sal, conviene agregar sta slo durante el amasijo. En algunos productos de panadera, como barquillos y galletas secas duras, las masas deben elaborarse con una menor adicin de agua; por otra parte, deben ser blandas y plsticas y poco elsticas para que se puedan moldear fcilmente. Por este motivo se prefiere el uso de una harina "floja", es decir, pobre en protenas totales (no ms de 11 %) y en gluten hmedo (mx. 22%), pues con contenidos ms elevados se necesita ms lquido para preparar la masa. Esto tiene el inconveniente de la formacin de una miga de, poros ms gruesos y un excesivo levantamiento del producto, formndose a menudo una superficie spera, irregular o con ampollas, grietas o fisuras en las galletas. Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines, puede regularse, la plasticidad de la masa frenando su desarrollo. Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una enzima proteoltica como la papana, que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa blanda, suave y extensible, y con menor tiempo de horneo. La cantidad por usar depende del contenido de gluten de la harina que se usa; pero, en general, un 0,5%; o, relacionando con 100 kilos de harina, 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes. Como toda enzima, la papana se destruye con la temperatura del horno de panificacin, por lo cual su accin debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa, de unos 15-20 minutos despus de su adicin. La dosificacin depende, en todo caso, de la humedad, tratamiento mecnico en el amasijo, pH, composicin y tiempo de reposo de la masa. Para asegurar una distribucin homognea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo. Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un ptimo entre 40 y 70C.

La enzima Amilasa es la encargada de degradar a los carbohidratos ricos en energa qumica, el proceso de degradacin qumica de esta Biomolcula comprende 3 transformaciones qumicas: 1 La Ptialina o Amilasa salival secretada por las glndulas salivales( partidas, submaxilares y sublinguales) comienza la degradacin del almidn rompiendo los enlaces glucosdicos del mismo. La 2 transformacin qumica del almidn ocurre en el Intestino delgado( en la Ampolla de Vater una zona dilatada de este rgano donde desemboca el jugo pancrtico rico en Amilasa pancretica quien termina por desdoblarlo en Disacridos como sacarosa, maltossa y otros. La 3 transformacin qumica ocurre en las glndulas intestinales por medio de la amilasa intestinal quien con otras enzimas colaboradoras como la Sacarasa, Maltasa, Lactasa, terminan de desdoblar al almidn en Monmeros simples de Alfa-Glucosa que sern absorvidos por las vellosidades y microvellosidades intestinales para ser transportadospor la sangre a todas las clulas del cuerpo. Saludos

Nombre sistemtico de la amilasa es (1,4) glucosidasa, lo que significa que ella hidroliza los enlaces 1-4 en polisacridos. Para completar hidrlisis en las ramificaciones se necesita otra enzima, (1,6) glucosidasa La mayora de las amilasas estn clasificadas en sistema de IUPAC en las familias 13, 14 y 15. Cada una de estas familias incluye de forma preferente cada uno de los tres principales tipos de actividad amilasa: -amilasa, -amilasa y glucoamilasa, respectivamente. Los enzimas de la familia 13 estn representados en todo tipo de organismos vivos. La presencia de enzimas de la familia 14 se limita a bacterias y plantas, y las de la familia 15 a bacterias y hongos. Alfa-amilasa (presente en el hombre) es una endohidrohilasa, quiere decir que rompe enlaces glucosidicos dentro de la molecula de polisacrido. En cambio beta-amilasa (de origen vegetal) es exohidrolasa especfica para el penltimo enlace (1,4) del extremo no reductor de polisacrido. Resultado de su accin va la formacin de conjunto de dmeros de glucosa conocidos con el nombre da la maltosa.

Resumen: METODO DE HIDROLISIS DE ALMIDON CON UNA ENZIMA DE ALFAAMILASA. CONSISTE EN EL TRATAMIENTO DEL ALMIDON, A UN PH ENTRE 3,5 Y 7,0 Y TEMPERATURA COMPRENDIDA ENTRE 50C Y 100C, CON LA ENZIMA ALFAAMILASA, DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTE PARA PRODUCIR UNA DISOLUCION DE HIDROLIZADO DE ALMIDON. LA ENZIMA ALFA-AMILASA SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO CORRESPONDIENTE AL GRUPO CLOSTRIDIUM SP. ATCC 39251, ATCC 39252, A LAS CEPAS MUTANTES DE LOS MISMOS, O A UN MICROORGANISMO QUE INCORPORA INFORMACION GENETICA DE LOS CITADOS MICROORGANISMOS, QUE CODIFICA LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA DE ALFA-AMILASA. TIENE APLICACIONES PARA LA PRODUCCION DE JARABES QUE CONTIENEN GLUCOSA.

Almidn. Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5), inodoro e inspido, en forma de grano o polvo. El almidn es el principal carbohidrato de reserva en la mayora de las plantas. En las hojas el almidn se acumula en los cloroplastos, donde es un producto directo de la fotosntesis. En los rganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos, en los cuales se forma despus de la translocacin de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas. En los vegetales, el almidn se encuentra en uno o ms granos amilceos en un plastidio. La cantidad de almidn en diversos tejidos depende de muchos factores genticos y ambientales. El almidn se acumula a la luz del da cuando la fotosntesis excede las tasas combinadas de respiracin y translocacin, despus parte de l desaparece por la noche. Se presentan dos tipos de almidn en la mayora de los granos amilceos: amilosa y amilopectina, ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces -1, 4. Las uniones -1, 4 hacen que las cadenas de almidn se enrollen en forma de hlices. La amilopectina consta de molculas muy ramificadas, cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces -1, 6). Las amilosas son ms pequeas y contienen de cientos a miles de unidades de glucosa, numero que depende de la especie y las condiciones ambientales. La formacin de almidn ocurre sobre todo por un proceso que implica la donacin repetida de unidades de glucosa provenientes de un azcar nucleotidico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de adenosina, ADPG. Hidrlisis del almidn. La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas. Las reacciones hidrolticas no son reversibles, de modo que no se pueden detectar sntesis de almidn por amilasas. Las amilasas estn diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que estn germinando, ricas en almidn. Es probable que la -amilasa tenga ms importancia que la -amilasa para la hidrlisis de almidn. Gran parte de la -amilasa se localiza dentro de los cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidn que atacara. Acta tanto en el da como por la noche aunque, por supuesto, durante la luz de da hay produccin neta de almidn por la fotosntesis. La amilopectina solo es degradada parcialmente por la accin del almidn fosforilasa. La reaccin procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones -1,6 de las ramificaciones, por lo que de nuevo que dan dextrinas. La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminacin repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La almidn fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difcil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidn en las clulas de inters.

OBJETIVO Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maz hidrolizan al almidn, dando como producto final unidades de maltosa siendo este uno de los mecanismos que la semilla utiliza para obtener energa necesaria para germinar. El alumno estudiara las diferencias en la actividad amiloltica, dependiendo de los estados de germinacin en las semillas y de sus requerimientos energticos. Se aplicara el mtodo de Nelson-Simogy para la determinacin de reductores totales. Determinaremos la actividad enzimtica de las semillas de maz, dependiendo de su tiempo de germinacin. MATERIAL 1 mortero 1 bistur 1 bao de agua hirviendo 6 tubos de centrifuga 5 pipetas graduadas de 10 ml 1 embudo de filtracin de 5 cm de dimetro 1 caja de Petri de 9 cm 1 tripi con tela de asbesto 1 mechero 25 tubos de ensayo de 15X150 1 centrifuga 1 espectrofotmetro 1 gasa 30 semillas de maz METODOLOGA

La preparacin de las semillas de maz, se llevara a cabo cinco das anteriores a la prctica. Se desinfectaran 10 semillas de maz en cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida; posteriormente las semillas las pondremos a germinar en un frasco limpio, en el frasco se pondr una capa de algodn, las semillas, y se humedecer el algodn. Despus el mismo procedimiento de germinacin se aplicara a otras cuantas semillas limpias pero tres das antes de la prctica. Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maz de ningn da de germinacin; despus se seleccionaron un par de semillas de 5, de 3 y 0 das de germinacin, entonces se les quita el embrin y el escueto, para que solo nos quede el endospermo almidonoso. Una vez limpios los maces prepararemos un extracto enzimtico de los respectivos das de germinacin; lo anterior se har macerando el endospermo de 2 semillas de 5 das de germinacin, en un mortero de con 5 ml de succinato con pH 5. Se hizo el mismo procedimiento

con las semillas de 3 y 0 das de germinacin, los productos obtenidos de los macerados se colocaran en tubos de centrfuga, lavando el mortero con el amortiguador en cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos. Despus de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo; para ser colocadas en los tubos numerados del 7 al 12, segn la relacin del formato siguiente. dias de germinacion 0 0 3 3 5 5

tubo # 7 8 9 10 11 12

ml extracto diluido 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

El ultimo paso de la practica ser la determinacin de los reductores totales, que se llevara a cabo con las diluciones de los extractos enzimticos de la semilla de diferentes tiempos de germinacin; aqu se realizan las reacciones con los diferentes reactivos (I y II) y la determinacin de azucares reductores totales que obtuvimos con la hidrlisis enzimtica del almidn; tambin realizaremos la curva patrn. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla. RESULTADOS

Anotaremos las lecturas espectrofotomtricas de cada tubo en la tabla siguiente. DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 0 0.086 0.377 0.297 0.339 0.464 0. 0.090 0.212 0.292 0.259 0.505 0 0.088 0.2945 0.2945 0.299 0.4845

TUBO 1 2 3 4 5 6

Determinaremos la concentracin de maltosa en los tubos 1 al 6 correspondientes a la curva patrn, de acuerdo con la ecuacin: (Volumen inicial)(Concentracin inicial) = (Volumen final)(Concentracin final) (Tubo x)(500 g/ml) = (Patrn maltosa + Agua)( X ) Se anota la concentracin en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan las lecturas espectrofotomtricas obtenidas en los tubos 1 a 6. Tabla 1. VALORES PARA CURVA PATRON X TUBO # 1 2 3 0 125 333.33 Y [Maltosa g/mL] 0 0.088 0.2945 Densidad ptica (520 nm)

4 5 6

750 2000 0

0.2945 0.299 0.4845

Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y. Debido a que los datos se presentan como una recta, se ajustan de ser necesario. En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de densidad ptica de los tubos problema (7-12). TUBOS DIAS PROBLEMA 0 0 3 3 5 5 7 8 9 10 11 12 1.229 0.833 0.990 1.218 1.252 0.989 0.844 1.106 1.071 1.200 1.114 1.164 DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 1.031 1.104 1.120 0.975 1.1355 1.139

Tomando en consideracin los datos de la curva patrn donde Y ha sido corregida Y y recordando nuevamente que y=0.0873x-0.0621; se calcula la concentracin de maltosa de los diferentes das de germinacin. Los datos se registran en la siguiente tabla. TUBO # 7 8 9 10 11 12 DIAS 0 0 3 3 5 5 [MALTOSA g] 0.0279 0.0342 0.0356 0.0230 0.0370 0.0373

En la siguiente grafica se encuentra la concentracin de maltosa por los das de germinacin de las semillas. DISCUSIN En esta prctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados. Creemos que nuestros resultados hubieran estado ms precisos si la extraccin del almidn no hubiera presentado algunas dificultades para obtener el endospermo. Esto lo pensamos ya que en las semillas de 0 y 3 das el endospermo presentaba partes ms duras, que hacan ms difcil la extraccin total. Otra cuestin a destacar, es la parte en que hacemos la segunda incubacin (reactivo 1), pues por un descuido el agua hirvi y se derramo un poco, provocando que a algn tubo le entrase agua y alterara una absorbancia; esto se nota pues el mismo nmero de tubo pero del duplicado da una lectura ms coherente. Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad enzimtica en la semilla es mayor si el tiempo de germinacin es mayor. CONCLUSIN

En esta prctica se esperaba y se observo la actividad enzimtica de la amilasa sobre el almidn. Observamos que al tener ms tiempo de germinacin una semilla, mayor es la actividad enzimtica de la amilasa. En los granos de cero das se manifest una actividad de la enzima muy baja, despus existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres das y por supuesto que la mayor actividad se registro en las semillas de 5 das. Todas estas reacciones nos dejan una produccin de maltosa, por accin de la hidrlisis enzimtica de la amilasa sobre el almidn; esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho, sera porque haba mucho almidn para hidrolizar y poder producir maltosa. En resumen y conclusin, la actividad enzimtica es directamente proporcional a la produccin de maltosa, todo esto con respecto a los das de germinacin que tengan las semillas (entre mas das de germinacin tenga las semillas, mas almidn habr, entonces, la actividad enzimtica ser mucho mayor.) CUESTIONARIO 1.- CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMIDON?

3 2.- QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR? Cuando en una determinacin cuantitativa de los monosacridos se realiza frecuentemente, basndose en su observacin en disoluciones alcalinas mediante Cu2+, Ag+ o ferricianuros, se origina una mezcla de azucares -cidos. Los azucares son capaces de reducir, a tales oxidantes se les denomina azucares reductores. Se puede definir tambin a un azcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un grupo carbonio y es susceptible de participar en otra oxidacin. 3.- QUE TIPO DE ENLACES HIDROLIZAN LAS AMILASAS? -Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa -Amilasa, (14) glucan maltodeshidrogenasa 4.- QUE AMILASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANISMOS ANIMALES? -D-glucopiranosa -Amilasa, (14) glucan 4-glucanohidrolasa BIBLIOGRAFA SALISBURY, B. FRANK

Fisiologa Vegetal, Ed. Iberoamericana, 1994. MATHEWS, C. K. Y VAN HOLDE, K. E. Bioqumica, McGraw Hill Interamericana, 2. Ed., Espaa, 1998. BRITNNICA CD 2000 DELUXE Encyclopdia Britannica, Inc. WHITE, A., HANDLER, P., SMITH, E., HILL, R., LEHMAN, R. Principios de Bioqumica, McGraw Hill, 1989. MICROSOFT EXCEL 2002 (10.2614.2625)