UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA

IDENTIFICACIN DE BACTERIAS HALOFILAS AISLADAS DE MUESTRAS DE SAL PROVENIENTES DEL SALAR DE UYUNI

MATERIA: Laboratorio de Investigacin TUTOR: Dr. Daniel Guzmn Duchen ESTUDIANTE: Arcani Aguilar Maribel CARRERA: Ingeniera Qumica

COCHABAMBA BOLIVIA 2012

RESUMEN La diversa cantidad de microorganismos existentes, y la importancia tecnolgica y cientfica de estos seres vivos nos dirigen a su estudio. El salar de Uyuni el cumulo de sal ms grande de Bolivia, como se estima, posee 10 mil millones de toneladas de sal aproximadamente, que contiene microorganismos halfilos de gran aplicacin tecnolgica, no solo de inters industrial, si no, tambin cuentan con propiedades fisiolgicas que facilitan su explotacin con propsitos comerciales. El Centro de Biotecnologa trabaja desde hace 10 aos en el aislamiento y caracterizacin de microorganismos halfilos como la Halomonas boliviensis el cual nos da una gua de la gran importancia de estos microorganismos. El presente trabajo tiene como objetivo contribuir en la diversidad microbiana de nuestro pas al realizar la identificacin de bacterias halfilas aisladas de muestras de sal provenientes del salar de Uyuni donde revisamos aspectos relacionados con su ecologa en los ambientes hipersalinos y sus caractersticas como microorganismos extremfilos y sus diversas e importantes aplicaciones y potencialidades en la industria y en la biotecnologa.

El microorganismo aislado de dicho Salar de Uyuni 3-BS y su rplica 3-BS son capaces de crecer en diferentes concentraciones de NaCl (0, 1, 3, 5, 8, 10, 15,20 y 25%), as mismo crecen en diferentes pH (5, 6, 7, 8, 9, 10) y temperaturas (30, 37, 45 C) a todas ellas se les observ parmetros de color, consistencia y densidad para as elegir el ptimo de cada propiedad fisicoqumica.

1.- INTRODUCCION La microbiologa se desarroll gracias al mejoramiento de instrumentos como los microscopios, tcnicas como la esterilizacin y la obtencin de cultivos puros.
[1]

Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes que tienen mltiples aplicaciones industriales; en el caso de los halfilos su uso biotecnolgico se ve orientada a diferentes campos, por ejemplo en la industria alimentaria en donde se requiere preservar y conservar las caractersticas sensoriales de los alimentos, en la industria de plsticos en la que se busca generar nuevas tecnologas amigables con el ambiente y en la industria farmacutica con la incorporacin de principios activos que originan nuevos productos.

Por lo tanto nos enfocamos principalmente en los microorganismos halfilos que han desarrollado complejos procesos de adaptacin que les han permitido hacer frente a las condiciones ambientales extremas que caracterizan a los ambientes salinos. Aunque el estudio de los microorganismos halfilos comenz hace cerca de un siglo, el mayor impulso en el conocimiento de estos microorganismos ha tenido lugar en los ltimos 25 aos. Actualmente sabemos que existe una gran diversidad de

microorganismos halfilos de los que apenas se han aislado y estudiado un pequeo porcentaje. [2] Actualmente est creciendo el inters por conocer mejor la diversidad de

microorganismos halfilos y cada vez es mayor el nmero de investigaciones relacionadas con el tema ya que estos organismos producen una amplia variedad de metabolitos secundarios estables que pueden tener aplicaciones prcticas. [3]

2.- OBJETIVOS 2.1.- OBJETIVO GENERAL Realizar una caracterizacin morfolgica y fenotpica de bacterias halfilas aisladas de muestras de sal provenientes del salar de Uyuni. 2.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS Aislar el microorganismo 3-BS y su rplica 3-BS (Bloques de Sal) por siembra en cajas petri, a partir de bloque un de sal perteneciente al salar de Uyuni. Determinar la concentracin optima de sal. Determinar la temperatura ptima. Efectuar pruebas para determinar el pH ptimo. Realizar las pruebas biolgicas para su posterior caracterizacin. Realizar las pruebas Bioqumicas para su posterior caracterizacin.

3.- MARCO TERICO 3.1.- BIOTECNOLOGA La biotecnologa se define como la utilizacin de los seres vivos o de sus procesos biolgicos, para la obtencin o modificacin de un producto, mejorar una especie vegetal o animal o la obtencin de un servicio. Otra definicin sera aplicacin de procedimientos cientficos para la transformacin de materias por agentes biolgicos para producir bienes y servicios. La biotecnologa microbiana o microbiologa industrial, da origen a los procesos a gran escala en los que se utilizan microorganismos para la obtencin de productos o servicios. En estos procesos se favorece el metabolismo de los microorganismos para tener el mximo rendimiento haciendo que las condiciones fsico-qumicas sean controladas y haciendo una seleccin de las variedades ms productivas.

As, por ejemplo una bacteria (E. coli) es capaz de fabricar la insulina humana. En esta etapa los avances en biotecnologa suponen una revolucin con aplicaciones claves en muchos sectores. Los microorganismos que se utilizan en microbiologa industrial deben cumplir unos requisitos: 1. Deben producir una sustancia de inters y que tenga alguna aplicacin. 2. Deben crecer en un cultivo puro de forma rpida y fabricar ese producto en el menor tiempo posible. 3. Deben consumir nutrientes de bajo costo. 4. Ser susceptibles de manipulacin gentica. 5. Que se puedan cultivar a gran escala.

Son pocos los microorganismos utilizados a nivel industrial. Esto se debe a que algunos casos sus productos metablicos, si se obtienen de forma industrial son ms caros; otras veces sus enzimas son aprovechadas en muchas aplicaciones.
[4]

3.2.- MICROORGANISMOS Los microorganismos son como su nombre lo dice organismos que solo pueden ser observados a travs de un microscopio. Son las primeras y ms primitivas formas de vida en nuestro planeta y tal vez en el universo, por lo que siempre han estado en compaa del hombre. La ciencia que estudia a los microorganismos es la microbiologa. Micro del griego (diminuto, pequeo) y bio del griego (vida) seres vivos diminutos. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia de las plantas y los animales, una organizacin biolgica elemental. En su mayora son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos centicos compuestos por clulas multinucleadas, o incluso multicelulares. Dentro de los microorganismos se encuentran organismos unicelulares procariotas, como las bacterias, y eucariotas, como los protozoos, una parte de las algas y los hongos, e incluso los organismos de tamao ultramicroscpico, como los virus. [5] 3.3.- CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales.

Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables. Esto es debido a dificultades intrnsecas en el cultivo. [6]

3.4.- FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO

Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si estudiamos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la que no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular. pH: Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica. El pH interno en la mayora de los microorganismos est en el rango de 6.0 a 7.0.

Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10. [7]

3.5.- MICROORGANISMOS EXTREMOFILOS

Ambiente extremo es aquel que presenta valores extremos de determinados parmetros fsico-qumicos tales como temperatura, pH, presin hidrosttica, potencial redox, actividad del agua, salinidad, irradiacin solar, concentracin de nutrientes o metales txicos, condiciones inusuales poco favorables o letales para la mayora de organismos. Los organismos que toleran e incluso requieren para su desarrollo estas condiciones se los denomina organismos extremfilos. [8]

Un extremfilo "amante de condiciones extremas" es un microorganismo que vive en condiciones extremas producen enzimas (extremoszimas) que son de gran importancia biotecnolgica, entendindose por tales aquellas que son muy diferentes a las que viven la mayora de las formas de vida en la Tierra. Hasta hace poco tiempo se pensaba que en los lugares donde crecen los extremfilos era imposible que hubiera vida. Las enzimas que poseen los extremfilos (apodadas extremo enzimas) son funcionales cuando otras no lo son. Podemos hacer la siguiente clasificacin:

Anhidrobiosis: Viven en ausencia de agua. Ejemplo: Selaginella lepidophylla Acidfilo: Se desarrollan en ambientes de alta acidez, como el Picrophilus. Alcalfilo: Se desarrollan en ambientes muy alcalinos (bsicos). Barfilo: Se desarrollan en ambientes con presin muy alta. Halfilo: Se desarrollan en ambientes hipersalinos, como las del gnero Halobacterium, que viven en entornos como el Mar Muerto.

Endolito: Organismo de suelos profundos. Viven a muchos metros bajo el suelo, incluso en medio de rocas.

Psicrfilo: Se desarrollan en ambientes de temperatura muy fra, como la Polaromonas vacuolata.

Radifilo: Soportan gran cantidad de radiacin, como la bacteria Deinococcus radiodurans.

Termfilo: Se desarrollan en ambientes a temperaturas superiores a 45C, algunos de ellos, los hipertermfilos tienen su temperatura ptima de crecimiento por encima de los 80C., como el Pyrococcus furiosus.

Xerfilo: Se desarrollan en ambientes con muy baja humedad.

Algunas bacterias pertenecen a varios de estos grupos hay archaeas (arqueobacterias), procariotas y eucariotas. Su pequeo tamao y el hecho de que su metabolismo es muy adaptable ha permitido que colonicen ambientes que son mortales para seres pluricelulares. Aunque hay que sealar que tambin hay organismos pluricelulares, sobre todo entre los barfilos. 3.6.- BACTERIA Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamao de unos pocos micrmetros (entre 0,5 y 5 m, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y hlices (espirilos). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las clulas eucariotas (de animales, plantas, hongos, etc.), no tienen el ncleo definido ni presentan, en general, orgnulos membranosos internos. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son mviles. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriologa, una rama de la microbiologa.
[10] [9]

Aunque el trmino bacteria inclua tradicionalmente a todos los procariotas, actualmente la taxonoma y la nomenclatura cientfica los divide en dos grupos. Estos dominios evolutivos se denominan Bacteria y Archaea (arqueas). La divisin se justifica en las grandes diferencias que presentan ambos grupos a nivel bioqumico y en aspectos estructurales. En los dominios Archaea y Bacteria se incluyen los organismos procariotas, esto es, aquellos cuyas clulas no tienen un ncleo celular diferenciado, mientras que en el dominio Eukarya se incluyen las formas de vida ms conocidas y complejas (protistas, animales, hongos y plantas). El trmino "bacteria" se aplic tradicionalmente a todos los microorganismos procariotas. Sin embargo, la filogenia molecular ha podido demostrar que los microorganismos procariotas se dividen en dos dominios, originalmente denominados Eubacteria y Archaebacteria, y ahora renombrados como Bacteria y Archaea, independientemente desde un ancestro comn.
[11]

que evolucionaron

Estos dos dominios, junto con el dominio Eukarya, constituyen la base del sistema de tres dominios, que actualmente es el sistema de clasificacin ms ampliamente utilizado en bacteriologa. [12] La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfolgicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias:

Coco (del griego kkkos, grano): de forma esfrica.

o o o o

Diplococo: cocos en grupos de dos. Tetracoco: cocos en grupos de cuatro. Estreptococo: cocos en cadenas. Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.

Bacilo (del latn baculus, varilla): en forma de bastoncillo. Formas helicoidales:

o o o

Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, juda o cacahuete. Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma de tirabuzn. Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal flexible).

FIGURA 1: Clases de Bacterias

Existen bacterias con mltiples morfologas

[13]

Algunas especies presentan incluso formas tetradricas

o cbicas

[14]

. Esta amplia

variedad de formas es determinada en ltima instancia por la composicin de la pared celular y el cito esqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes, unirse a superficies o moverse en presencia de estmulos. [15]
[16]

Las bacterias exhiben una gran variedad de tipos metablicos. La distribucin de estos tipos metablicos dentro de un grupo de bacterias se ha utilizado tradicionalmente para definir su taxonoma, pero estos rasgos no corresponden a menudo con las clasificaciones genticas modernas. El metabolismo bacteriano se clasifica con base en tres criterios importantes: el origen del carbono, la fuente de energa y los donadores de electrones. Un criterio adicional para clasificar a los microorganismos que respiran es el receptor de electrones usado en la respiracin. [17] Segn la fuente de carbono, las bacterias se pueden clasificar como:

Hetertrofas, cuando usan compuestos orgnicos. Auttrofas, cuando el carbono celular se obtiene mediante la fijacin del dixido de carbono.

Las bacterias auttrofas tpicas son las cianobacterias fotosintticas, las bacterias verdes del azufre y algunas bacterias prpura. Pero hay tambin muchas otras especies quimiolitotrofas, por ejemplo, las bacterias nitrificantes y oxidantes del azufre. [18] Segn la fuente de energa, las bacterias pueden ser:

Fototrofas, cuando emplean la luz a travs de la fotosntesis. Quimiotrofas, cuando obtienen energa a partir de sustancias qumicas que son oxidadas principalmente a expensas del oxgeno (respiracin aerobia) o de otros receptores de electrones alternativos (respiracin anaerobia).

Segn los donadores de electrones, las bacterias tambin se pueden clasificar como:

Litotrofas, si utilizan como donadores de electrones compuestos inorgnicos. Organotrofas, si utilizan como donadores de electrones compuestos orgnicos.

3.7.- MICROORGANISMOS HALOFILOS Los microorganismos halfilos han desarrollado complejos procesos de adaptacin que les han permitido hacer frente a las condiciones ambientales extremas que caracterizan a los ambientes salinos. Uno de los ms importantes mecanismos de adaptacin que han desarrollado estos microorganismos es la acumulacin intracelular de solutos u osmolitos compatibles, y cuya principal caracterstica es la de no interactuar con el metabolismo celular, por lo que su funcin es puramente osmtica. [19]
[20]

Los microorganismos halfilos son organismos que estn especializados para vivir en ambientes salinos, el trmino halfilo se origina del griego hals (sal) y phil (afn) por lo que etimolgicamente halfilo significa amigo, amante de la sal).
[21]

Los ambientes hipersalinos son ambientes extremos que se caracterizan por presentar elevadas concentraciones de sal. Estos ambientes presentan, a ms de un alto contenido de iones (factor que le atribuye la caracterstica de ser un ambiente inhspito para la mayora de los microorganismos), caractersticas ambientales peculiares tales como elevadas o muy bajas temperaturas, elevados valores de pH o bajas concentraciones de oxgeno. [22]

En los ambientes hper salinos se han descrito diversidad de seres vivos; esta variedad vara en una funcin de determinados parmetros como la salinidad, la composicin inica, la solubilidad del oxgeno, el pH o la temperatura. [23]

Las altas concentraciones salinas afectan a la estabilidad de las protenas, as las enzimas extracelulares producidas por bacterias halfilas poseen unos mecanismos especficos que las hacen permanecer estables a elevadas salinidades.

Las enzimas producidas por bacterias halfilas suelen tener carcter marcadamente cido en su superficie si se compara con las enzimas no halfilas, estos residuos cidos contribuyen a la estabilidad de las mismas.
[24]

3.7.1.- Bacterias halfilas

La sal comn, en elevadas concentraciones, es considerada generalmente como un inhibidor del crecimiento microbiano, por lo que ha sido ampliamente utilizada como un aditivo para la conservacin de alimentos, curtido de pieles, etc. Sin embargo, existe gran cantidad de microorganismos, como los halfilos que son capaces de vivir en estas condiciones. Esto es posible porque a lo largo de su evolucin, los microorganismos halfilos han desarrollado diversas propiedades o mecanismos de adaptacin a dichos ambientes, hasta tal punto que ms de una gran afinidad realmente se trata de una gran dependencia por la sal.
[25]

Estos microorganismos extremofilos se encuentran generalmente en lagos salinos cuya salinidad es la de saturacin o sobresaturacin. El trmino halfilo extremo se utiliza para indicar que estos organismos no solamente son haloflicos, sino que su requerimiento de sal es muy alto, en algunos casos cercanos a la saturacin. La principal caracterstica de las bacterias halfilas es la necesidad de NaCl en el hbitat, las concentraciones necesarias de sal para su crecimiento varan entre las distintas especies, se ha determinado que el requerimiento de sal en muchas bacterias halfilas aumenta con la temperatura. El rango de salinidad ptimo de crecimiento de las bacterias tambin se relaciona directamente con la concentracin de nutrientes presentes en el medio.
[26]

El criterio no est universalmente unificado pero por trmino medio se consideran dos tipos de halfilos propiamente dichos.

Halfilos moderados, cuando presentan un crecimiento ptimo en medios que contienen entre el 5 y 20 % de NaCl.

Halfilos extremos, si crecen pticamente en medios que presentan una concentracin entre el 20-30% de NaCl.

Los

requerimientos

nutricionales

de

las

bacterias

halfilas

moderadas

varan

considerablemente entre las diferentes especies, en el laboratorio se ha determinado que uno de los medios ms recomendados para su cultivo son los enriquecidos con un 0,5% de extracto de levadura
[27]

. La mayora de las bacterias halfilas son sensibles a metales

pesados como mercurio, plata y zinc, algunas bacterias presentan una alta tolerancia al cobalto, nquel y cadmio, la toxicidad del cadmio cobalto y cobre disminuye con el aumento de salinidad, la toxicidad del nquel y zinc disminuye en aumento de concentracin de extracto de levadura presente en el medio de cultivo. [28]

Tienen una va separada de creacin de energa aparte de la fotosntesis que crecen ptimamente en un rango de salinidad de 0,5 a 2,5 M; adems producen una serie de enzimas hidrolticas extracelulares tales como: amilasas, proteasas, lipasas, nucleasas y esterasas. [29] [30]

Algunos de estos halfilos pertenecen al dominio Archaea. Estas bacterias son fciles de cultivar y presentan escasos requerimientos nutricionales; su tolerancia a elevadas concentraciones salinas reduce al mnimo los riesgos de contaminaciones en el laboratorio, lo que permitira su explotacin como fbricas celulares alternativas a Escherichia coli, para la produccin de protenas recombinantes. Son tiles en la produccin de enzimas, polmeros, solutos compatibles y en la biodegradacin de residuos, as como en la produccin de alimentos fermentados.

En este sentido, se han reportado una serie de enzimas extracelulares como proteasas, amilasas, DNasas, pululanasas y lipasas producidas por bacterias halfilas.
[31]

3.8.- PRUEBAS BIOQUMICAS Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
[32]

Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas bioqumicas, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.

La realizacin de una prueba bioqumica implica: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hr. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados.

Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. En la tabla 1 se muestra el conjunto de pruebas bioqumicas que se realizan comnmente. [33] TABLA N 1 TIPO DE ANALISIS ENZIMAS VINCULADAS CON LA RESPIRACIN DESCOMPOSICIN DE AZCARES, CIDOS ORGNICOS Y OTROS FUENTE NICA DE CARBONO UTILIZACIN DE COMPUESTOS NITROGENADOS DESCOMPOSICIN DE CARBOHIDRATOS, AMINOCIDOS Y OTROS DETECCIN DE EXOENZIMAS TEST DE CRECIMIENTO O INHIBICIN PRUEBAS BIOQUIMICAS Oxidasa, Catalasa Requerimiento de oxgeno, Produccion de acido Asimilacin, Desnitrificacin Indol , H2S, Fenilalanina, Lisina, arginina, Urea Lecitinasa, Proteasas, Celulasas, Desoxirribonucleasas, Amilasas Temperatura, NaCl, Antibiticos

3.9.- 16s rRNA (Ribosomal 16S del RNA) 16s ARN ribosomal (o 16s rRNA ) es un componente de la 30S subunidad pequea de procariotas ribosomas . Es aproximadamente 1,5 kb (o 1500 nucletidos ) de longitud. Los genes que codifican para que se conozcan como 16s rDNA se utilizan en la reconstruccin de filogenias . Varias secuencias de 16s rRNA pueden existir dentro de una nica bacteria. [34] La filogenia es el estudio de la evolucin y desarrollo de las especies. La comparacin de secuencias de algunas macromolculas, es la forma ms precisa y confiable para inferir en las relaciones filogenticas.

Las tcnicas del DNA recombinante nos ayudan a clasificar a los organismos de un modo ms correcto, de acuerdo a su filogenia. Actualmente se utilizan los estudios del rRNA 16S o 18S, porque son secuencias que se han mantenido bastante uniformes a lo largo de la evolucin, y por eso se ven claramente las diferencias entre los distintos microorganismos y se pueden realizan rboles filogenticos. Estos estudios filogenticos basados en el rRNA nos dan una informacin que hace organizar a los distintos organismos de otro modo como podemos ver en el rbol de la vida.

As se reconocieron las tres lneas primarias de evolucin, denominadas dominios: Eucarya (eucariotas), Bacteria (inicialmente eubacterias) y Archeae (inicialmente arqueobacterias).

rRNA, abren nuevas perspectivas en cuanto a diversidad se refiere pues se tienen nuevos conceptos y modos de clasificacin de los organismos existentes y as pues adems de los tres dominios citados existiran unos doce reinos ms en Eucarya y otros tantos ms en Bacteria, esto da una nueva perspectiva de la diversidad en el planeta. As slo una mnima parte de los microorganismos han sido descritos y mucho menos han sido analizados.

La secuencia rRNA 16S, ha facilitado grandemente la identificacin y clasificacin taxonmica de bacterias ya que permite establecer relaciones filogenticos objetivas entre distintos organismos, incluyendo microorganismos no cultivables.

Consecuentemente, estas pueden ser utilizadas para determinar relaciones taxonmicas entre especies que presentan poca interrelacin en su DNA.

El empleo del 16s rRNA ha revolucionado la forma de identificar y clasificar taxonmicamente una bacteria.

Pero, adems, la secuenciacin del 16S rDNA tambin permite la deteccin de nuevas especies bacterianas, no descritas con anterioridad. De hecho, este enfoque ha permitido la deteccin, identificacin y caracterizacin de una pltora de nuevas especies residentes en el las mucosas humanas y muchas otras estn pendientes de confirmacin.
[35]

4.- MATERIALES Y METODOLOGIA 4.1.- MATERIALES 4.1.1.- Equipos Balanza analtica Incubadora shaker. Autoclave Cmara de flujo laminar Hornilla elctrica Micropipetas pHmetro - Refrigerador 4 C.

4.1.2. Material de laboratorio Matraces erlenmeyer, de 500ml., 250 ml y 100 ml. Cajas Petri Probeta Vasos de precipitado Tubos Falcn Asa (estril) Gradilla para tubos de ensayo. - Parafilm - Guantes - Papel aluminio - Gasa - Algodn - Pinzas

4.1.3.- Reactivos - medio (HM) Extracto de levadura Peptona Glucosa MgSO4 .7H2O NaBr KCl CaCl2 Agar - NaCl

4.2.- METODOLOGIA Para la identificacin de bacterias halfilas aisladas de muestras de sal provenientes del salar de Uyuni se procedi a los siguientes pasos: 4.2.1.- Aislamiento En microbiologa para lograr la separacin de bacterias se realiza procedimientos de aislamiento. Donde esto permite separar bacterias en cultivos puros, por lo tanto se

prepar medios de cultivo solidos HM en cajas petri previamente esterilizadas que contena inicialmente 10% NaCl y pH 7 para luego realizar la siembra en las mismas dentro la cmara de flujo laminar tomando dos colonias con las mismas caractersticas visuales (3 BS y su rplica 3 BS) Posteriormente se procedi a la incubacin de las cajas a una temperatura de 37C, donde pasado de 24 hr. Se bacterias. 4.2.2.- Pruebas fisicoqumicas Obtencin de la concentracin ptima de NaCl A partir del cultivo puro obtenido diluir una pequea porcin de las respectivas bacterias (3 BS y su rplica 3 BS) en el medio de cultivo lquido para luego sembrarlas en cajas Petri sobre medio HM (Anexo 1) que contienen diferentes concentraciones de sal mostradas a continuacin: 0, 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25,30%, (w/v) NaCl Obtencin del pH optimo A partir del cultivo puro obtenido diluir una pequea porcin de las respectivas bacterias (3 BS y su rplica 3 BS) en el medio de cultivo lquido para luego sembrarlas en cajas Petri sobre medio HM (Anexo 1) ya preparado con la concentracin optima de sal que se encuentran y diferentes valores de pH mostradas a continuacin: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 realiz el control del crecimiento y reproduccin de las

As mismo proceder a la incubacin de las cajas a 37C al cabo de 24 hr realizar el control del crecimiento y reproduccin de las bacterias por lo cual tambin es necesario esperar la respuesta de las bacterias que no crecieron para as obtener el respectivo rango de crecimiento de las bacterias sometidas a esas condiciones. Obtencin de la temperatura optima A partir del cultivo puro obtenido diluir una pequea porcin de las respectivas bacterias (3 BS y su rplica 3 BS) en el medio de cultivo lquido para luego sembrarlas en cajas Petri sobre medio HM (Anexo 1) ya preparado con la concentracin y pH optimo que se sometern a diferentes temperaturas mostradas a continuacin: 4,30, 37,40 C As mismo proceder a la incubacin de las cajas a las temperaturas mencionadas y observar el crecimiento celular luego de 24 hr. 4.2.3.- Prueba biolgica Para la realizacin de la prueba de asimilacin de diferentes fuentes de carbono se utiliz el kit Biolog GN2 que consta de 96 pruebas diferentes, para esto se procedi de la siguiente manera: Diluir una pequea porcin de las respectivas bacterias (3 BS y su rplica 3 BS) preparadas con las condiciones ptimas de concentracin de sal y pH en sales marinas (Sea Salt) para luego introducir 100-150l en cada uno de los pocillos del kit que corresponde a 95 fuentes de carbono diferentes y un blanco (referencia). As mismo proceder a la incubacin de los kit Biolog GN2 por un lapso de 24 hr a una temperatura de 37C, posteriormente se observa un cambio de coloracin con cada fuente de carbono que contiene cada pocillo, este cambio de coloracin (a rosado suave) nos indica una reaccin positiva para la correspondiente fuente de carbono.

4.2.4.- Pruebas bioqumicas Acidificacin Preparar medios de cultivo HM modificado (Anexo 2) donde se utilizar distintos carbohidratos al 1% (fuentes de carbono), con la concentracin optima de sal y pH utilizando como indicador rojo fenol. Posteriormente sembrar en cada caja Petri las bacterias 3 BS y su rplica 3 BS (cultivo puro) en los correspondientes medios solidos ya preparados. As mismo proceder a la incubacin de las cajas a la temperatura ptima donde pasado 24 hr se tendr que observar un cambio de coloracin con cada fuente de carbono (carbohidrato) de rojo a amarillo el cual significa que la correspondiente bacteria consumi dicho fuente de carbono. Antibiticos (prueba de inhibicin) Los antibiticos son efectivos contra las bacterias ya que inhiben la formacin de la pared celular o detienen otros procesos de su ciclo de vida. Por lo tanto las para la prueba de inhibicin se tendr que tener cajas Petri con el respectivo medio solido HM preparado con la concentracin de sal y pH ptimo. En la cmara de flujo laminar se procede a sembrar las respectivas bacterias 3 BS y su rplica 3 BS seguidamente se coloca los distintos antibiticos elegidos que se encuentran en forma circular pequeos.

5.- RESULTADOS 5.1.- PRUEBAS FISICOQUMICAS

Tabla 2: Resumen de las pruebas realizadas.

TABLA 2 PRUEBAS FISICOQUIMICAS Rango de crecimiento NaCl (%, w/v) ptimo de NaCl (%, w/v) Rango de crecimiento pH pH optimo Rango de crecimiento temperatura (C) Temperatura optima (C)

3-BS 0 - 25 5 5 -10 6 4 - 40 37

3-BS 0 - 25 5 5 - 11 6 4 - 40 37

5.1.2.- Obtencin de concentracin optima de sal A partir de la siembra de la bacteria 3-BS y 3-BS en los medios de cultivos HM se obtuvo el crecimiento correspondiente con cada concentracin de NaCl A continuacin se muestra en la tabla 3.

BACTERIA 3 - BS

BACTERIA 3-BS

CONCENTRACION CRECIMIENTO CONCENTRACION CRECIMIENTO DE SAL DE SAL DE LA DE LA BACTERIA BACTERIA (%, w/v) (%, w/v) 0 1 3 5 8 10 15 20 25 30 + + + + + + + + + 0 1 3 5 8 10 15 20 25 30 + + + + + + + + + Figura 2:Concentracion Optima de sal 5% NaCl - Bacteria 3 BS

Figura 3: Optimo 5% NaCl (replica de 3 BS) Bacteria 3BS

5.1.3.- Obtencin del pH optimo

Tabla 4
3- BS
pH
CRECIMIENTO

3-BS
pH CRECIMIENTO
Figura 4: Optimo pH 6 Bacteria 3BS

4 5 6 7 8 9 10 11

+ + + + + + -

4 5 6 7 8 9 10 11

+ + + + + + +

Figura 5: Optimo pH 6 (replica de 3BS)Bacteria 3BS

5.1.4.- Obtencin de temperatura optima

Tabla 5
3- BS ( C)
4 30 37 40 + + +

3-BS ( C)
4 30 37 40 + + +

TEMPERATURA CRECIMIENTO TEMPERATURA CRECIMIENTO

Figura 6: Temperatura optima 37C Bacteria 3BS

Figura 7: Temperatura optima 37C Bacteria 3BS

5.7.- PRUEBA BIOLOGICA Biolog GN2 MicroPlateTM est diseado para la identificacin y caracterizacin de una gama muy amplia de bacterias Gram-negativas. Biolog MicroPlateTM GN2 realiza 95 pruebas discretas simultneamente y da un patrn de reaccin caracterstica que se llama "huella metablica. Al introducir las respectivas bacterias en cada diferente fuente de carbono donde al cabo de 24h se pudo observar un cambio de coloracin ha rosado suave en algunas de las muestras que indica que el cambio de color se produjo debido a que la bacteria consumi la correspondiente fuente de carbono.

Figura 8: Kit biolog GN2 MicroPlateTM Bacteria 3-BS

Figura 9: Kit biolog GN2 MicroPlateTM Bacteria 3- BS

A continuacin se muestra los resultados obtenidos de la prueba biolgica en la Tabla 6 y Tabla 7.

TABLA 6: Kit Biolog GN2

BACTERIA 3 BS (Bloques de Sal)

A1 Water

A2 Cyclodextrin

A3 Dextrin

A4 Glycogen

A5 Tween 40

A6 Tween 80

A7 N-Acetyl-DGalactosamine

A8 N-Acetyl-DGlucosamine

A9 Adonitol

A10 L-Arabinose

A11 D-Arabitol

A12 D-Cellobiose

+ B1
i-Erythritol B2 D-Fructose

+
B3 L-Fucose

+
B4 D-Galactose

B5 Gentiobiose

B6 -D-Glucose

W+
B9 Lactulose

+
B10 Maltose

+
B11 D-Mannitol

+
B12 D-Mannose

B7 m-lnositol

B8 -D-Lactose

W+
C1 D-Melibiose

+
C2 -MethylD-Glucoside

C3 D-Psicose

C4 D-Raffinose

C5 L-Rhamnose

+
C6 D-Sorbitol

C7 Sucrose

C8 D-Trehalose

C9 Turanose Xylitol

C10

+
C11 Pyruvic Acid

+
C12 Succinic Acid Mono-MethylEster D12 -Hydroxybutyric Acid

D1 Acetic Acid

+
D3 Citric Acid

D4 Formic Acid

D5 D-Galactonic Acid Lactone

+
D7 D-Gluconic Acid

+
D8 DGlucosaminic Acid

D9 DGlucuronic Acid

Methyl Ester

+
D2 Cis-Aconitic Acid D6 DGalacturonic Acid D10 Hydroxybutyric Acid

+
D11 Hydroxybutyric Acid

+
E1 p-Hydroxy Phenylacetic Acid F1

E2 Itaconic Acid

+
E3 -Keto Butyric Acid

W+
E4 -Keto Glutaric Acid

E5 -Keto Valeric Acid

E6 D,L-Lactic Acid

+
E7 Malonic Acid

E8 Propionic Acid

E9 Quinic Acid

W+
E10 D-Saccharic Acid

E11 Sebacic Acid

+
E12 Succinic Acid

W +
F6

F11 Glycyl -LAspartic

F2

W+
F3

F4

W+
F5

F7 L-Alanylglycine F8 L-Asparagine

F9 L-Aspartic Acid

F10 L-Glutamic Acid

F12 Glycyl - LGlutamic

Bromosuccinic Succinamic Acid Acid

Glucuronamide L-Alaninamide D-Alanine

L-Alanine

W W+
G2

G4 L-Ornithine L-

+
G6 L-Proline

G8 D-Serine

G1 L-Histidine

W+
G3 L-Leucine G5 G7 L-Pyroglutamic Acid

G9 L-Serine

W+
G10 L-Threonine

Acid G11

Acid G12

Hydroxy-LProline

D,L-Carnitine

-Amino Butyric Acid

W+
H1 Urocanic Acid

H3 Uridine

H4 Thymidine

Phenylalanine

W+
H6 Putrescine

W
+

+
H9

W+
H10 D,L--Glycerol

H11 -D-Glucose-

W
Inosine

H5 Phenyethyl-

+
H8 H12 D-Glucose2,3-Butanediol Glycerol

H2

H7 2Aminoethanol

W+

amine

Phosphate

1-Phosphate

6-Phosphate

W+

TABLA 7: Kit Biolog GN2

BACTERIA 3BS (Bloques de Sal)

A1 Water

A2 Cyclodextrin

A3 Dextrin

A4 Glycogen

A5 Tween 40

A6 Tween 80

A7 N-Acetyl-DGalactosamine

A8 N-Acetyl-DGlucosamine

A9 Adonitol

A10 L-Arabinose

A11 D-Arabitol

A12 D-Cellobiose

B1
i-Erythritol B2 D-Fructose

+
B3 L-Fucose

W+
B4 D-Galactose

B5 Gentiobiose

B6 -D-Glucose

B9 Lactulose

+
B10 Maltose

B11 D-Mannitol

W+
B12 D-Mannose

B7 m-lnositol

W+
B8
-D-Lactose

C1 D-Melibiose

+
C2 -MethylD-Glucoside

C3 D-Psicose

C4 D-Raffinose

C5 L-Rhamnose

+
C6 D-Sorbitol

C7 Sucrose

C8 D-Trehalose

C9 Turanose

C10 Xylitol

W+
C11 Pyruvic Acid Methyl Ester

W+
C12 Succinic Acid Mono-Methyl-

D1 Acetic Acid

+
D3 Citric Acid

D4 Formic Acid

D5 D-Galactonic Acid Lactone

+
D6 DGalacturonic Acid

D9 DGlucuronic Acid

D10 Hydroxybutyric Acid

D2 Cis-Aconitic Acid D7 D-Gluconic Acid D8 DGlucosaminic Acid

D11 Hydroxybutyric Acid

Ester
D12

-Hydroxybutyric Acid

E1 p-Hydroxy Phenylacetic

E2 Itaconic Acid

W+
E3 -Keto Butyric Acid

W+
E4 -Keto Glutaric Acid

E5 -Keto Valeric Acid

E6 D,L-Lactic Acid

+
E7 Malonic Acid

E8 Propionic Acid

E9 Quinic Acid

E10 D-Saccharic Acid

E11 Sebacic Acid

E12 Succinic Acid

F7 L-Alanylglycine

F11 Glycyl -LAspartic

Acid F1 Bromosuccinic Acid

F2 Succinamic Acid

F3

F4

W+
F5 D-Alanine

+
F6 L-Alanine

F8 L-Asparagine

F9 L-Aspartic Acid

W+
F10 L-Glutamic Acid + G10 L-Threonine

W+
F12 Glycyl - LGlutamic

Glucuronamide L-Alaninamide

+ G5
LPhenylalanine

+ G6
L-Proline

G8
D-Serine

G1 L-Histidine

W+
G2 Hydroxy-LProline

+ G3
L-Leucine

G9 L-Serine

Acid
G11

Acid
G12

G4
L-Ornithine

G7 L-Pyroglutamic Acid

D,L-Carnitine

-Amino Butyric Acid

W+
H1 Urocanic Acid

H3 Uridine

H4 Thymidine

+
H6 Putrescine

H8 2,3-Butanediol

+
H9 Glycerol

+
H10 D,L--Glycerol

H11 -D-Glucose-

+
H7 2Aminoethanol

W+
H12 D-Glucose-

H2 Inosine

H5 Phenyethyl-

W+

amine

W+

Phosphate

1-Phosphate

6-Phosphate

W+

5.3.- PRUEBA BIOQUIMICA Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc.

En la prueba de acidificacin se utiliz el indicador rojo fenol indicador de pH que se utiliza para visualizar la produccin de cidos donde dio un color rojo a cada medio de cultivo (medio HM con diferentes carbohidratos).Cada fuente de carbono es usada para que el microorganismo realice su crecimiento y desarrollo. El resultado obtenido de la prueba de acidificacin es que se puede observar que en algunas de las cajas petri se observ un cambio de color rojo a amarillo el cual significa que la

correspondiente bacteria consumi dicho fuente de carbono as mismo hubo otras que no cambiaron de color. Los resultados de esta prueba nos indican que la prueba es positiva si se observa un cambio de color rojo a amarillo, intermedio entre el rojo y el amarillo es considerado como dbilmente positivo.

Antes

despus

Figura 10: Medios de cultivo (cajas Petri) que muestran los cambios de color en los correspondientes medios acidificados.

A continuacin se muestra los resultados en la tabla 8 TABLA 8 ACIDIFICACIN D-(+)-Galactosa D-(+)-Manosa D-(+)-Trehalosa dihidratada D-Manitol D-(+)-Rafinosa pentahidratada D-(+)-Celobiosa L-Rhamnosa monohidratada D-Sorbitol D-(-)-Fructuosa D-(+)-Glucosa D-(+)-Maltosa D-(+)-Xylosa D-Lactosa monohidratada D-(+)-Arabinosa Sacarosa

3-BS + + + + + + + + + +

3-BS + W+ + + + + + + + + + +

En la prueba de inhibicin con antibiticos se obtuvo los siguientes resultados mostrados en la tabla 9 TABLA 9 ANTIBIOTICO Cefradina Nitrofurantoina Ampicilina Kanamicina Cloranfenicol Tetraciclina Tobramicina Cefuroxima Amoxicilina- Ac.Clavulanico 3-BS + W+ + W+ + + + + 3-BS + W+ + W+ + W+ + +

Por lo tanto se puede observar cada una de las pruebas realizadas con los respectivos antibiticos. Cada inhibicin en el crecimiento de la bacteria tiene su respectivo dimetro (D) determinado segn las recomendaciones del fabricante.

BACTERIA 3- BS

1.-Cefradina D=3cm

2.- Nitrofurantoina D=1.8cm 5.- Cloranfenicol D=3 cm 4.- Kanamicina D=1.7cm

Figura 11: Prueba con antibiticos 3.-Ampicilina D=2.5cm

Figura 12: Prueba con antibiticos 6.- Tetraciclina D= 3.3 cm

7.- Tobramicina resistente

9.- Amoxicilina D=2.9cm

Figura 13: Prueba con antibiticos 8.- Cefuroxima D=3.5cm

BACTERIA 3 BS

4.- Kanamicina D=1.4cm 1.-Cefradina D=3cm 3.-Ampicilina D=2.9cm

6.- Tetraciclina resistente

Figura 14: Prueba con antibiticos 2.- Nitrofurantoina D=1.9cm

Figura 15: Prueba con antibiticos 5.- Cloranfenicol D=2.6 cm

7.- Tobramicina D=1.6cm

9.- Amoxicilina D=2.6cm

Figura 16: Prueba con antibiticos 8.- Cefuroxima D=3cm

6.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 6.1.- Conclusin Las bacterias halfilas al pertenecer al grupo de microorganismos extremfilos capaces de vivir en ambientes salinos ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnologa.

As, no slo producen compuestos de enorme inters industrial, como enzimas, biopolmeros o solutos compatibles, sino que adems presentan unas propiedades fisiolgicas que facilitan su explotacin comercial. As pues es obvio que existe un gran potencial de aplicaciones de inters biotecnolgico procedente de los microorganismos halfilos. Seguramente, muchas an no las conocemos. Pero en los ltimos aos se est haciendo un gran esfuerzo, potenciando los proyectos de investigacin destinados a buscar nuevos productos entre microorganismos extremofilos: halfilos por lo cual cabe esperar un futuro muy prometedor en el campo de la biotecnologa de estos microorganismos. Se concluye que al realizar el presente trabajo se identific parcialmente a la cepa y en base a los resultados obtenidos estas bacterias 3 BS y su rplica 3 BS poseen diferentes reacciones en las pruebas bioqumicas a pesar de tener algunas semejanzas. Segn estudios realizados en el Salar de Uyuni se tiene una gran posibilidad de que otras cepas sean nuevas especies. Las propiedades fisicoqumicas optimas de la bacteria halfila 3 BS y su rplica 3 BS son: 5% (w/v) de NaCl, pH 6, temperatura 37C. Esta prueba bioqumica se fundamenta en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc. Ya que los microorganismos necesitan de fuentes de carbono para su crecimiento y desarrollo.

As mismo cabe resaltar que la bacteria 3 BS (llamada as porque an no posee un nombre) tiene la capacidad de producir cidos cuando tiene como fuente de carbono los siguientes carbohidratos: Manosa, Trehalosa dihidratada, Manitol, Fructuosa, Glucosa, Maltosa, Xylosa, Lactosa monohidratada, Arabinosa y Sacarosa. En la rplica 3 BS los siguientes carbohidratos tienen la capacidad de producir cidos: Galactosa, Manosa, Trehalosa dihidratada, Manitol, Xylosa, Lactosa monohidratada, Arabinosa y Sacarosa. Los antibiticos son efectivos contra las bacterias ya que inhiben la formacin de la pared celular o detienen otros procesos de su ciclo de vida. En cuanto a la prueba de inhibicin con antibiticos la bacteria 3 BS resulto sensible a los siguientes antibiticos: Cefradina, Nitrofurantoina, Ampicilina, Kanamicina, Cloranfenicol, Tetraciclina, Cefuroxima , Amoxicilina y resistente a los efectos de la Tobramicina Su rplica 3 BS resulto sensible a: Cefradina, Nitrofurantoina, Ampicilina, Kanamicina, Cloranfenicol, Cefuroxima , Amoxicilina, Tobramicina y resitente a los efectos de la Tetraciclina. 6.2.- Recomendacines Con respecto a la parte de identificacin de las bacterias halfilas, se recomienda realizar otras pruebas bioqumicas adicionales como ser la prueba de hidrolisis. Sorbitol, Fructuosa, Glucosa, Maltosa,

As mismo se recomienda realizar la identificacin filogentica por secuenciacin del gen 16s ADN identificacin gentica de un nmero representativo de colonias. La identificacin bacteriana basada en secuencias 16s DNA se ha convertido en uno de los mtodos ms potentes para identificar cualquier microorganismo desconocido.

8. - BIBLIOGRAFIA 1. Pachn Rojas Mabel, Maestra: enciclopedia temtica ilustrada, Editorial Norma, Edicin 2007 - Seccin Biologa Pg. 14.

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34. http://en.wikipedia.org/

35. http://www.arareko.net/biology/bacterial_phylogeny/index.pdf

ANEXOS Para 100 ml de solucin ANEXO 1. Medio de cultivo Heterotrfico (HM) Porcentaje 1% 0,5% 0,1% 0,025% 0,05% 0,009% 0,006% 0 20% Reactivos Extracto de Levadura. Peptona. Glucosa. Sulfato de Magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O). Cloruro de Potasio (KCl). Cloruro de Calcio dihidratado (CaCl2 2H2O). Bromuro de Sodio (NaBr). Cloruro de Sodio (NaCl)

ANEXO 2. Medio de cultivo Heterotrfico (HM) modificado

Porcentaje 0.3% (w/v) 0,025% 0,05% 0,009% 0,006% 5%optimo 1%

Reactivos Extracto de Levadura. Sulfato de Magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O). Cloruro de Potasio (KCl). Cloruro de Calcio dihidratado (CaCl2 2H2O). Bromuro de Sodio (NaBr). Cloruro de Sodio (NaCl) Carbohidrato