Drosophila melanogaster neurobiologija, neurofarmakologija i kako se vinska mus ica mo e iskoristiti u istra ivanjima delovanja lekova/narkotika u centralnom nervnom

sistemu
Apstrakt Otkrida na polju delovanja narkotika u centralnom nervnom sistemu u postgenomskoj eri rapidno evoluiraju. Starije empirijske metode zamenjuje novija tehnologija, koja ukljuuje bioinformatiku, strukturalnu biologiju, genetiku i savremene raunarske pristupe. U potrazi za novim farmakolokim terapijama, osobito u leenju poremedaja centralnog nervnog sistema, dolazi do ekspanzije spoznaje principa da jednostrani bioloki pristup nije recept za uspeh; neophodna je ira perspektiva. Sistemska biologija je jedan od takvih pristupa i u porastu je njeno priznavanje kao veoma bitne oblasti istraivanja, poto postavlja specifine molekularne targete/mete u kontekst celokupnih biohemijskih dejstva. Razumevanje kompleksnih interakcija izmeu komponenti unutar odreenog biolokog sistema koji vode modifikaciji izlaza/odgovora (output), poput promena u ponaanju ili razvidu, mogu biti bitni pravci otkrida za identifikaciju novih terapija. Jedan pravac u istraivanju lekova koji sadri ogroman potencijal je upotreba model organizama poput vinske muice, Drosophila melanogaster. Slinosti u nainu delovanja lekova, ponaanju i genetikom odgovoru izmeu D. melanogaster i sistema sisara, u kombinaciji sa mogudnostima genetike, su odskora od muice uinili veoma atraktivan sistem za prouavanje fundamentalnih neurofarmakolokih procesa relevantnih za bolesti ljudi. Mogudnosti koje upotreba model organizama poput muice prua je brzina, visok protok i dramatino smanjenje trokova, to bi sve zajedno trebalo da dovede do poboljanja stope otkrida. 1. Uvod Otkrida na polju delovanja narkotika u centralnom nervnom sistemu u postgenomskoj eri rapidno evoluiraju. Starije empirijske metode zamenjuje novija tehnologija, koja ukljuuje bioinformatiku, strukturalnu biologiju, genetiku i savremene raunarske pristupe. Ipak, ove novije metode su do sada imale ogranien uspeh, delom zato to identifikacija i validacija cilja/targeta pretstavlja stvarnu prepreku njihovoj efikasnoj primeni. Sa svim ovim novim dostupnim sredstvima, pitanja koja se moraju postaviti su: ta da radimo sa njima? Kako mooemo na najbolji nain da ih upotrebimo? Svi izgleda da se slau sa injenicom da predstavljaju modnu tehnologiju, kad bi samo znali kako na najbolji nain da je iskoristimo. U potrazi za novim farmakolokim terapijama, a osobito u leenju poremedaja CNS-a, dolo je do porasta spoznaje da jednostrani bioloki pristup malo verovatno recept za uspeh; neophodnaa je ira perspektiva. Sistemska biologija je jedan od takvih pristupa i u porastu je njeno priznavanje kao veoma bitne oblasti istraivanja, poto postavlja specifine molekularne targete/mete u kontekst celokupnih biohemijskih dejstva. Razumevanje kompleksnih interakcija izmeu kommponenti unutar odreenog biolokog sistema koje vode modifikaciji odgovora, poput promena u ponaanju ili razvidu, mogu biti bitni pravci u istraivanju i identifikaciji novih terapija. Jedan pravac u istraivanju lekova koji sadri ogroman potencijal je upotreba model organizama poput vinske muice, Drosophila melanogaster. Genetiki model organizam predstavlja intaktne ive sisteme kod kojih kompleksni bioloki obrasci i procesi lako mogu biti ispitani. Osim toga, slinosti u nainu delovanja lekova, ponaanju i genetikom odgovoru izmeu D. melanogaster i sistema sisara, u kombinaciji sa mogudnostima genetike, su odskora od muice uinili veoma atraktivan sistem za prouavanje 1

fundamentalnih neurofarmakolokih procesa relevantnih za bolesti ljudi. Iako je muica u mnogim pogledima veoma slina kimenjacima, itaoc bi trebalo da ima u vidu da svaki sistem koji se prouava verovatno ima kljune razlike koje bi trebalo uzeti u obzir kada se koristi muica kao model. Mogudnosti koje upotreba model organizama poput muice prua je brzina, visok protok i dramatino smanjenje trokova, to bi sve zajedno trebalo da dovede do poboljanja stope otkrida. Ovaj prikaz bi stoga trebalo da poslui kao osnova poznacanja neurofarmakologije Drosophila. Nemamo nameru da prezentujemo sveobuhvatnu diskusiju o svim bitnim ili atraktivnim osobinama Drosophila kao organizama. Ovaj prikaz je namenjen istraivaima koji su se primarno fokusirali na sisarske model sisteme i ele da steknu perspektivu kako muica moe ili posluiti kao doupuna ili u potpunosti zameniti njihov model sistem tokom istraivanja delovanja lekova u svojim laboratorijama. Ovaj prikaz bi osobito trebao biti privlaan onima u farmacutskoj industriji, suoenim sa trenutnim pootekodama identifikacije i validacije targeta (delovanja)... U praktinom smislu, nadamo se da de ovaj prikaz ohrabriti upotrebu D. melanogaster u laboratorijama u kojima su njene prednosti i potencijal potcenjeni. 2. Drosophila melanogaster kao model organizam 2.1 Uvod Obina vodna muica, D. melanogaster je , i bila je prethodnih 100 godina, u prvom planu biolokih istraivanja. Tomas Hant Morgan je 1908. otkrio mujaka belih oiju u svom toku. Nastavljajudi sa ovim otkridem, zajedno sa kolegama Startevantom, Bridisom i Milerom, proirio je teoriju Mendelovog nasleivanja i koncept da su zapravo hromozomi nosioci gentikog materijala. Pedesith godina 20. veka muicu kao model sistem je koristio Ed Luis u pionirskim radovima elucidacije strukture gena i definisanja genskih lokusa koji obuhvataju introne i egzone. Sedamdesetih godina, novi putevi istraivanja Drosophila su otvoreni kada je Sejmur Bencer razvio muicu kao model za izuavanje genetikih osnova kompleksnih ponaanja. Ranih 1980ih Eril Vajos i Kristijan Nislajn-Volhart su zavrili studije koj su identifikovale znaajan broj gena ukljuen u sve aspekte embrionskog razvida muice. to je jo vanije, mnogi od ovih gena su imali funkcionalne ortologe kod ljudi i njihov rad je omogudio kljuno shvatanje vedine, ako ne svih, aspekata procesa razvida kod sisara. Ovaj pionirski rad na vinskoj muici , pored Luisovog izuavanja homeotinih genskih kompleksa, je nagraen Nobelovom nagradom za medicinu i fiziologiju, koju su dobili Vajos, Nislajn-Volhart i Luis 1995. Ipak, tek od skora je muica poela da se koristi u neurofarmakolokim istraivanjima i kao platforma terapeutskih otkrida u CNS. Mogudnost koju invertebratski model, poput D. melanogaster, prua je poboljana brzina istraivanja iskoridavanjem prednossti njihove sofisticirane genetike, kratkog perioda generacije i llakode upotrebe u odnosu na sisarske modele. Takoe je vredno pomena dad trenutna regulacija brige o ivotinjama i njjihovog koridenja koji se odnose na istraivanja na kimenjakim ivotinjama se ne odnose na Drosophila. 2.2 Genom Najatraktivniji aspekti genetikih modela poput vinske muice ukljuuje kompaktna veliina genoma i brz period generacije. Celokupan genom Drosophila je sekvenciran i oznaen i pretpostavlja se da obuhvata oko 14 000 gena (Celniker and Rubin, 2003). Poreenja radi, za humani genom se pretpostavlja da ima izmeu 20 000 i 25 000 protein-kodirajudih gena (Human Genom Sequencing, 2004). Osim toga, muica 2

ima 4 hromozoma, od kojih 3 nose vedinu gena. Kod muice je razvijen veliki broj raznovrsnih sofisticiranih genetikih manipulacija,od kojih su mnoge kasnije bile primenjene i na sisarske siteme. Verovatno je najmodnija od ovih tehniika je mogudnost jednostavnog stvaranja transgenih ivotinja i izvoenje irokog spektra pretraivanja mutanta. Osnovne tehnike transgenetike su razvijene u raznovrsne napredne sisteme koji pruaju mogudnost veoma specifine kontrole vremenske i prostorne ekspresije bilo koje date sekvence. Oni ukljuuju markere poput lacZ i GFP (green fluorescent protein), mutante alela za kreiranje hipomorfa i hipermorfa i RNK interferenciju za selektivne knockdown ekspresije gena. Jo jedan bitan aspekt genetike Drosophila je dostupnost balansiranih hromozoma. Ovo su preureeeni i markirani hromozomi tako da se onemogudava odigravanje rekombinacije, omogudavajudi identifikaciju i odravanje recesivnih mutant alela, koji bi u suprotnom mogli biti letalni. 2.3 ivotni ciklus Reproduktivni ivotni ciklus Drosophila je 10-12 dana na 25C. Tek poloenom jajetu treba oko 24h da podlegne embriogenezi i da se razvije u prvi stadijum larve. Za jo oko 24h, ova larva se presvue u larvu drugog stadijuma. Posle jo jednog dana, larva podlee poslednjem presvlaenju u larvu tredeg stadijuma. Posle dva dana u ovom stanju, larva ispuzi iz hranljivog supstrata i razvije se u imobilnu pupu/lutku. Tokom narednih 5 do 7 dana, pupa podlee drastinoj fizikoj transformaciji u adultnu formu, nakon ega izlazi iz omotaa lutke (eklozija). Adultna enka moe da se pari oko 12h psle eklozije. Ono to je bitno ej da jedan enka moe da poloi na stotine jaja u roku od nekoliko dana. Kratak period generacije i veliki broj potomaka ine relativno lakim da se dobije na hiljde mutanta u genetikom istraivaju za nekoliko nedelja. 2.4 Konzervirani molekularni mehanizmi Muica se kao ivotinja veoma razlikuje od oveka. Stoga se ini neverovatnim da su molekularni procesi koji se odvijaju u muici veoma slinim onim koji se odvijaju kod oveka. Uprkos razlikama u veliini genoma, prcenjuje se da preko 60% genan oveka ima funkcionalnog ortologa kod Drosophila (Bernards and Hariharan, 2001). Iako je sveukupna identinost nukleotida ortologa oko 40%, a slinost je izmeu 40% i 50% kod ortologih proteina, specifini regioni koji ukljuuju katalitike domene i druge osobine ispoljavaju vie od 80% slinosti. Ipak, oko 30% gena nema ni najmanje slinosti sa genima drugih organizama. Kako je kasnije opisano, procesi koji koriste ove ortologe za razvijanje ose polarnosti, metabolike porcese, organogenezu i razvide nervnog sistema su konzeervirani do tako visokog stepena da se vrlo esto supstitucijom gena muice genima oveka i obrnuto, u ovim procesima dobija ispravna funkcionalnost! 2.5 Konzervirano ponaanje Nasuprot jednostavnijim model organizmima, muice pokazuju irok opseg kompleksnog ponaanja, relevantih za ponaanje sisara i drugih viih organizama. Ona ukljuuju cirkadijalni ritam, spavanje, uenje i memoriju, udvaranje, ishranu, ispoljavanje agresije, doterivanje i navigaciju letenja (Greenspan and Dierick, 2004; Greenspan and van Swinderen, 2004). Zaista, mnoge molekularne i geenetike komponente ovih tipova ponaanja, popput razliitih aspekata molekularne osnove formiranja memorije, su prvo bili otkriveni kod muice a potom tek identifikovani kod sisarskih sistema. Ono to je 3

binto, to demo kasnije pomenuti u ovom pregledu, odgovor na farmakoloke supstance koje deluju u CNS-u, poput psihostimulansa, je veoma slian. 3. Centralni nervni sistem Drosophila 3.1 Uvod Prouavanje centralnog nervnog sistema kod Drosophila je u stvari ispitivanje 3 posebna sistema, definisana vremenom razvida. U ovom odeljku, itaocu de biti prezentovan kratak sinopsis razvida CNS-a i fukncije tokom embrionskog, larvalnog i adultnog stadijuma. Svaki od ovih stadijuma prua jedinstveni pogled na razvojne i mhanistike procese, od kojih su mnogi rekapitulirani u sisarskim sistemima koji su doprineli razumevanju bolesti kod oveka i identifikaciji targeta novih terapija. Slika 1 ilustruje CNS Drosophila u kljunim stadijumima razvida, sa obeleenim bitnim strukturama. Embrionski CNS je od posebnog znaaja pri istraivanju delijske sudbine (proliferacije/diferencijacije) i usmeravanja aksona (Slika 1A). U larvalnom CNS (Slika 1B), prouavanje sinaptike strukture i funkcije se pokazala kao veoma informativna. Ispitivanje razvida vizuelnog sistema larve tredeg stadijuma se pokazalo vano za prouavanje odluivanja o sudbini delije, formiranje obrazaca i delijskih interakcija. Adultni CNS (Slika 1D) je moda najvaniji u ovom prikazu i procesu otkrida lekova, i savie detalja de biti razmotren us lededem odlejku. Kod adulta je mogude kombinovati kompleksne bihejvioralne eksperimente sa istraivanjima iz polja genetike, elektrofiziologije i farmakologije u svrsi utvrivanja funkcije i kola CNS-a. 3.2 Embrionski centralni nervni sistem Prouavanje embrionskog CNS-a ukljuuje istraivanje primarno procesa u razvidu poput odluke o razvidu delija i usmeravanja aksona. Tokom ovog stadijuma embrion muice se razvija od jedne oploene delije do larve prvog stadijuma, gde je funkcionalni nervni sistem neophodan kako bi novoizlegla larva mogla da puzi i pronae hranu i zaklon.