DENEYN ADI : izgi Plaka Yntemi (Srme Yntemi) ve Slant Yntemi ile Saf Kltr Elde Etme ZET

Amaca ve izolasyon yntemine gre sv veya kat besiyeri, genel veya selektif besiyeri kullanlr. zolasyon amacyla kullanlan tm yntemlerde besiyeri seimi en nemli kriterdir. Mikroorganizma izolasyonunun temel basama koloni elde edilmesidir. Koloni, kat besiyerinde tek bir hcrenin oalmas sonunda meydana gelen milyonlarca hcrenin oluturduu yap olarak tanmlanr. Bir dier deyi ile koloni tek bir hcreden oluur yani koloninin besiyerinden alnarak steril serum fizyolojik iinde sspanse edilmesi ile saf kltr elde edilmi olur. Bu sspansiyondan, daha sonra almann amacna gre uygun sv veya kat besiyerine ekim ya da mikroskobik incelemeler yaplr. Saf kltr elde edilirken genel olarak srasyla aadaki ilemler yaplr. ncelikle izolasyonda kullanlacak materyalin zelliine gre farkl n ilemler yaplr. Numune kat ise nce serum fizyolojik veya ringer zeltisi veya peptonlu su ile muamele edilerek kat materyaldeki mikroorganizmalarn svya geirilmesi salanr. Numune sv ise sadece homojenizasyon ilemi yaplr. ncelenecek numuneden, petri kutusundaki uygun agarl bir besiyerine tek koloni drme teknii ya da yayma teknii kullanlarak ekim yaplr. Petri kutular uygun scaklk ve srede inkbasyona braklr. nkbasyon sonras petri kutularnda oluan, birbirine temas etmeyen ve izole edilmek istenen mikroorganizmann zelliklerine uygun olan koloni ze, krdan veya a inesi yardm ile alnarak sv veya kat bir besiyerine aktarlr. nkbasyonun ardndan izolatn saf olup olmadn incelemek amacyla saflk kontrol yaplr.

ekil.1.Kat besiyerinde saf kltr elde edilmesi

YNTEM 1. izgi Plaka Yntemi (Srme Yntemi) Bu yntemle petri kutusundaki kat besiyerinin belirlenen farkl blgelerine numune ile temas ettirilen zenin srayla srlmesiyle numunenin miktar ve ierdii mikroorganizma says giderek azalr. Bylece bakterilerin her srme alanna bir nceki alandan daha az sayda dmeleri salanr. Son srme alannda bakteri says teke der. Bu bakteriler teke dtkleri blgelerde oalarak tek koloni oluturur. Bu yntemle ekimin amac her canl hcrenin inkbasyon sonucu bir (1) adet koloni oluturmasdr. Bu nedenle srme yntemine tek koloni drme yntemi de denir.

ekil.2. Srme yntemiyle ekim ekilleri Srme yntemiyle ekim u ekilde yaplr: Ekimi yaplacak rnek ze veya pipet ile sv besiyerine ekim ilemindeki gibi alnr.

Agarl besiyerini ieren petri kutusu sol elin ayasna yerletirilir ve bu elin ba ve iaret parma ile kapak ksm alr. ze bu aralktan ieri sokularak ze ucunun rnek alnan ksm agar yzeyinin seilecek bir blgesine temas ettirilir. rnek bu blgede hafife ezilerek birka mm apnda yaylr. Daha sonra ze ile bu yaylma alanndan balayarak srme ilemine geilir. Srme ilemi deiik ekillerde gerekletirilebilmektedir. Ancak ayr ayr koloni elde edebilmek iin en ideal olan 4 ayr blgenin izilmesidir. Srme yaplrken zenin agar yzeyinde uygun a ile tutulmasna ve agar yzeyini paralamadan temas ettirilmesine dikkat edilmelidir. Srme olay ilerledike rnekteki mikroorganizma says, zenin ilk srld blgeye gre gittike azalacaktr. Bunun sonucunda da inkbasyondan sonra, son srme ilemlerinin yapld agar yzeyi blgelerinde izole koloniler elde edilebilecek, dier bir deyimle koloniler tek tek debilecektir. kinci, nc ve drdnc ekim blgelerine her geite ze, bek alevinde tutularak soutulduktan sonra bir nceki blgeye temas ettirilir ve srme ilemine devam edilir.

ekil.3. zeyi her seferinde yakarak yaplan izgi ekim Srme ilemi bitince petri kutusunun kapa kapatlarak inkbasyona braklr. Agar yzeyinde bir blgeden dier blgeye geite ka defa srme yaplaca, aktarma yaplan rnekteki mikroorganizma ykn tahmin etmeye baldr.

2. Tpte yatk agar (Slant Teknii) Kltr koleksiyonu vb. pek ok amalarla kullanlan agarl besiyeridir. Ama, tpte geni bir yzey elde etmektir. Standart deney tplerine 7 ml. olacak ekilde tam olarak eritilmi agarl besiyeri datlr ve otoklavlanr. Otoklav sonrasnda besiyeri henz sv iken tpler bir ubuk zerine yatrlarak katlamas salanr. Bu aamada dikkat edilmesi gereken husus, tplerin dip ksmlarnn yaklak 2,5 cm derinliinde olmasdr.

ekil.4. Yatk kltr hazrlama

3. Saf Kltrn Kontrol Saflk kontrol iin petri kutusundaki agarl besiyerine srme yaplarak inkbasyon sonras burada oluacak koloninin ekil, byklk, yap, renk gibi zellikleri incelenir. Farkl zellie sahip koloni varl gzlendiinde, bu durum kltrn kark olmas anlamna gelir ve tekrar tek koloni alnarak saflk kontrolne kadar ilemler tekrarlanr. Besiyerinde ayn tip koloni gzlenmesi incelenen kltrn saf kltr olduu anlamna gelir. Besiyerinde ayn tip koloni gzlense bile tek koloni alnarak tekrar izolasyon ilemi yaplmas da genel olarak nerilmektedir. 4. EMB Agar Mikst bakteri populasyonundan gram negatif basillerin izolasyon ve differansiyasyonu iin kullanlr. In vitro (canl hcre dnda) yaplan standart mikrobiyolojik analizlerde E. coli ve dier Enterobacter trlerinin izolasyon ve ayrm ile Candida albicans 'n hzl tanmlanmas iin selektif kat besiyeri olarak kullanlr. 4.1. Bileim Peptone 10,0 g/L; Lactose 10,0 g/L; K2HPO4 2,0 g/L; Eosin yellowish 0,4 g/L; Methylene blue 0,065 g/L; Agar-agar 13,5 g/L

ekil.5. EMB Agar

4.2. Etki ekli Bileimdeki boyalar, pek ok Gram pozitif bakterinin geliimini basklar. Koaglaz pozitif stafilokoklar karakteristik renksiz ve toplu ine ba byklnde koloni oluturarak geliirler ve bunlara koaglaz testi uygulanabilir. Koliform grup bakteri analizinde yayma ya da srme ile inokle edilen Petri kutular aerobik olarak 35 oC'da 1-2 gn inkbe edilirken, Candida analizi %10 CO2 atmosferinde yaplr.

DENEY 1: izgi Plaka Yntemi (Srme Yntemi) ile Saf Kltr Elde Edilmesi MATERYAL MRS Agar EMB Agar Back Alev Mezr 100 ml. 3 Adet Petri Kab ze E.Coli ve Lactabacillus Casei Saf Kltrleri DENEYN YAPILII Otoklavdan aldmz steril 3 adet petri kabna yine otoklavdan aldmz MRS agardan 20er ml. mezrde ltkten sonra koyduk ve donmaya braktk. Bu arada krmz renkli EMB agardan 20 ml. alarak petri kabna koyduk ve onuda donmaya braktk.

ekil.6. Petri Kaplarna Dktmz Agarlar

Agarlar petri kaplarnda donduktan sonra back alevden geirdiimiz ze ile tpte bulunan Lactabacillus Casei kltrnden 1 lup aldk ve petri kabndaki donmu agar zerine sk izgilerle izdik. Bir taraf izdikten sonra zeyi tekrar alevden geirdik ve izmeye bir nceki izgi sonundan daha az sklkta izmeye devam ettik.

ekil.7. Petri Kabnn ze ile 1. izimi

ekil.8. ze ile 2.Blge izimi

Alevden geirdiimiz ze ile 3. blgeyi dahada az sklkla zigzag eklinde izmeye devam ettik. Tekrar zeyi alevden geirdik ve son blgeye zeyi srdk.

ekil.9. ze ile 3.Blge izimi

ekil.10. ze ile 4.Blge izimi

Srme ilemi bitince petri kutusunun kapa kapatlarak ve petri kaplarnn zeri yazlarak inkbasyona braklr. 24 saat sonunda petri kaplar kontrol edilir reyen kltr var ise saym yaplr. E.Coli kltrnden 1 lup aldk ve petri kabndaki donmu agar zerine sk izgilerle izdik. Bir taraf izdikten sonra zeyi tekrar alevden geirdik ve izmeye bir nceki izgi sonundan daha az sklkta izmeye devam ettik. Alevden geirdiimiz ze ile 3. blgeyi dahada az sklkla zigzag eklinde izmeye devam ettik. Tekrar zeyi alevden geirdik ve son blgeye zeyi srdk. Srme ilemi bitince petri kutusunun kapa kapatlarak ve petri kaplarnn zeri yazlarak inkbasyona braklr. 24 saat sonunda petri kaplar kontrol edilir reyen kltr var ise saym yaplr.

DENEY 2: Tpte Yatk Agar (Slant Teknii) ile Saf Kltr Elde Edilmesi MATERYAL 2 Adet Deney Tp MRS Agar

EMB Agar ze E.Coli ve Lactabacillus Casei Saf Kltrleri DENEYN YAPILII 2 Adet deney tpmzden birine deney tpnn 3te 2sini dolduracak ekilde MRS Agar, dierine ise EMB Agar koyduk ve yatk bir ekilde donmaya braktk. Ama yzey alann geni tutmakt. Donma ilemi bittikten sonra zenin ucunu ine ekline getirdik ve alevde tuttuk. Alevden sonra donmu MRS agar iine bir delik atk. zeyi tekrar alevden geirdik ve tpteki Lactabacillus Casei rnei iine daldrdk daha sonra zeyi agarda atmz delik iine braktk. Baka bir zeyi alevden geirdik ve rnee daldrp bir lup aldk. Deney tpnn yatk ksmnn en sonuna dedirdik ve yukarya kadar ze ile izdik. Pamuumuzla tp kapattk ve etvde 37oCde 24 saat inkbasyona braktk. Yukarda anlattmz ilemi EMB agarl tpe E.Coli ekerek yaptk. O tpde etvde 37oCde 24 saat inkbasyona braktk.

ekil.11. Sol Tpte Lactabacillus Casei ,Sa Tpte E.Coli Saf Kltrleri